健脾益肺方对hSODl-G93A转基因小鼠小胶质细胞活化的影响

发布时间：2019-10-22 19:36

【摘要】：目的:肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种罕见的神经系统疾病,表现为肌无力、肌萎缩,伴构音障碍、吞咽困难等,最终呼吸衰竭,目前缺乏特效治疗方法。本研究拟采用hSOD1—G93A转基因小鼠,给予不同浓度健脾益肺方灌胃处理,并通过评估其体重变化、运动功能、生存期等指标观察健脾益肺方的疗效;应用组织免疫荧光,检测腰段脊髓前角神经元核蛋白(Neuronal Nuclei,NeuN)、小胶质细胞特异性标志物整合素α M(CD11b)及核转录因子NF-k B p65的荧光情况,初步探讨健脾益肺方对ALS模型小鼠小胶质细胞活化调控作用及相关机制。方法:1.将hSOD1—G93A转基因小鼠随机分为:生理盐水组、低浓度健脾益肺方组、中浓度健脾益肺方组和高浓度健脾益肺方组;同窝普通野生型小鼠设为阴性对照组。每组小鼠6只。模型小鼠按分组予生理盐水或对应浓度健脾益肺方灌胃,阴性对照组予等量生理盐水灌胃。每日灌胃一次。2.测定小鼠体重,通过Weydt评分确定发病时间及生存期,通过悬尾试验、衣架悬挂试验、疲劳转棒试验等评价运动功能。统计分析各组间差异。3.各组小鼠终末期经取材、固定、冰冻切片后,进行免疫荧光染色。正置荧光显微镜×40倍物镜下观察并拍照。利用Image J软件测定前角NeuN阳性细胞计数、CD11b阳性活化小胶质细胞计数及NF-κB p65荧光强度核/浆比。统计分析各组间差异。结果:1.体重变化治疗前,生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠体重差异没有统计学意义(P0.05)。治疗后,前期四组模型小鼠的体重随时间均呈增加趋势,增加幅度基本无差异。16周龄开始,各组体重差异具有统计学意义(P0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较,低浓度健脾益肺方组体重差异无统计学意义(P0.05);中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠体重下降幅度明显延缓,差异具有统计学意义(P0.05、P0.01)。2.发病期和生存期生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的发病时间依次为:(88.83±4.12)天、(101.33±5.75)天、(108.83±6.68)天、(113.50±10.74)天。与生理盐水组比较,低浓度健脾益肺方组发病时间没有明显差异,中浓度和高浓度健脾益肺方组模型小鼠的发病时间明显延迟,差异具有统计学意义(P=0.986、0.035、0.001)。生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的生存期依次为:(125.17±3.71)天、(132.17±2.93)天、(138.50±5.05)天、(143.83±3.97)天。与生理盐水组比较,低浓度、中浓度和高浓度健脾益肺方组的生存期显著延长,差异具有统计学意义(p=0.017、0.000、0.000)。3.运动功能:衣架悬挂试验:9-14周龄,生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠掉落次数处于低水平的稳定状态,各组没有明显差异。15-16周龄,生理盐水组掉落次数迅速增多,同时期健脾益肺方组情况基本稳定。17周龄开始,生理盐水组模型小鼠不能耐受试验,健脾益肺方组掉落次数迅速增多。与生理盐水组模型小鼠比较,低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组掉落次数减少,差异具有统计学意义(均P0.01)。疲劳转棒试验:9-13周龄,生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠掉落次数处于低水平的稳定状态,各组没有明显差异。14-17周龄,生理盐水组掉落次数迅速增多,同时期,健脾益肺方组模型小鼠情况基本稳定。18周龄开始,生理盐水组模型小鼠不能耐受试验,同时期的健脾益肺方组掉落次数迅速增多。与生理盐水组模型小鼠比较,低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组掉落次数减少,差异具有统计学意义(P0.05)。4.NeuN阳性细胞计数生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠依次为:(3.83±0.98)个/视野、(4.17±1.17)个/视野、(4.83±1.17)个/视野、(7.83±1.17)个/视野。阴性对照组为:(9.17±0.75)个/视野。与阴性对照组比较,生理盐水组模型小鼠前角NeuN阳性细胞计数明显减少,差异具有统计学意义(P0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较,低浓度、中浓度健脾益肺方组模型小鼠的NeuN阳性细胞计数差异无统计学意义,而高浓度组明显增多,差异有显著统计学意义(P0.01)。5.CD11b免疫荧光表达激活型小胶质细胞计数:生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的CD11b阳性细胞表现为胞体呈不同程度地增大,细胞突起增粗、变短,呈激活的小胶质细胞。CD11b阳性细胞激活型小胶质细胞计数依次为:(17.50±1.05)个/视野、(15.00±1.41)个/视野、(12.33±1.63)个/视野、(9.17±1.47)个/视野。阴性对照组为:(0.33±0.52)个/视野。与阴性对照组比较,生理盐水组模型小鼠激活型小胶质细胞计数明显增多,差异具有统计学意义(P0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较,低浓度、中浓度和高浓度健脾益肺方组模型小鼠的CD11b阳性激活型小胶质细胞计数显著减少,差异有显著统计学意义(P0.05、P0.01、P0.01)。激活型小胶质细胞占比:生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的CD11b阳性细胞中激活型小胶质细胞占小胶质细胞总计数比值依次为:(19.15±1.67)%、(16.67±1.76)%、(13.35±1.61)%、(10.05±1.80)%。阴性对照组为:(0.35±0.55)%。与阴性对照组比较,生理盐水组模型小鼠的激活型小胶质细胞占比明显升高,差异具有统计学意义(P0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较,低浓度健脾益肺方组模型小鼠无明显差异(P=0.052),而中浓度、高浓度健脾益肺方组激活型小胶质细胞占比明显下降,差异具有统计学意义(均P0.01)。6.NF-κB p65免疫荧光强度核/浆比生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠依次为:(1.389± 0.035)%、(1.394±0.020)%、(1.211 ±0.059)%、(1.206±0.056)%。阴性对照组为:(20.42±5.10)%。与阴性对照组比较,生理盐水组模型小鼠的p65荧光强度核/浆比明显升高,差异具有统计学意义(P0.01)。与生理盐水组模型小鼠比较,低浓度健脾益肺方组无明显差异(P=0.995),中浓度和高浓度健脾益肺方组均明显下降,差异有统计学意义(均P0.01)。结论:1.hSOD1-G93A转基因小鼠发病后体重下降严重,运动功能减退,生存期缩短;健脾益肺方治疗hSOD1-G93A转基因小鼠能延缓发病时间,延长生存期,保持体重,改善运动功能。2.hSOD1-G93A转基因小鼠发病后存在腰段脊髓前角神经细胞丢失、小胶质细胞活化增生和NF-κB p65核转移程度增高;高浓度健脾益肺方能减轻模型小鼠脊髓神经元丢失情况;中、高浓度健脾益肺方能抑制模型小鼠脊髓小胶质细胞活化,抑制NF-κB p65核转移过程。3.健脾益肺方的作用靶点可能是通过抑制NF-κB信号通路,减少小胶质细胞活化,从而发挥抗神经炎症的作用,减少神经元损害和丢失,延缓疾病进展。
【图文】：

小鼠,组模型,生理盐水,体重变化

图１不同分组ａｌｓ小鼠的体重变化逡逑＋ＮＳ组：生理盐水组模型小鼠；ＡＬＳ＋Ｌ组：低浓度健脾益肺方治疗组；Ａ方治疗组；ＡＬＳ＋Ｈ组：高浓度健脾益肺方治疗组。治疗前，生理盐水度健脾益肺方组模型小鼠体重差异没有统计学意义（Ｐ＞0．邋０５）。治疗重随时间均呈增加趋势，增加幅度基本无差异。生理盐水组和低浓度始，体重随时间呈逐渐下降趋势；中浓度健脾益肺方组从第１５周开下降趋势；高浓度健脾益肺方组从第１６周龄开始体重随时间呈逐渐下，，１６周龄开始，各组体重差异具有统计学意义（Ｐ＜０．邋０１）邋？进一步Ｄ生理盐水组模型小鼠比较，低浓度健脾益肺方组体重差异无统计学意肺方组从１７周龄开始体重差异具有统计学意义（Ｐ＜０．邋０５）；高浓度始体重差异具有统计学意义（Ｐ＜０．邋０１）。逡逑析逡逑验结果说明，中、高浓度健脾益肺方可明显延迟ＡＬＳ模型小鼠效延缓体重下降的幅度，而低浓度健脾益肺方组的体重下降与较差异并不明显。逡逑

发病时间,小鼠

健睥益肺方对ｈＳ０Ｄ１＿Ｇ９３Ａ转基因小鼠小胶质细胞活化的影响方法逡逑ＳＰＳＳ１８．邋０软件分析实验结果。生存期和发病时间采用Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉ据以均数土标准差表示。多组间差异比较采用单因素方差分析，ｅｔｔ－ｔ检验。Ｐ＜０．邋０５表示差异有统计学意义。逡逑果逡逑益肺方对ＡＬＳ模型小鼠发病时间的影响逡逑盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠的发病４．１２）天、（１０１．３３±５．７５）天、（１０８．８３±６．邋６８）天、（１１３．邋５析结果发现，这四组的发病时间差异具有显著统计学意义（Ｆ＝２ｕｒｍｅｔｔ－ｔ检验结果显示，与生理盐水组比较，低浓度健脾益肺延迟，中浓度和高浓度健脾益肺方组模型小鼠的发病时间明显学意义（Ｐ＝0．邋９８６、０．０３５、０．００１）。（见表１、图２）。逡逑验结果表明，中、高浓度健脾益肺方能够显著延迟ＡＬＳ模型小１0１逦１￣￣逡逑0逡逑
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】