大弹涂鱼抗菌肽hepcidin基因的分子克隆与表达研究

发布时间：2019-11-07 18:44

【摘要】：哺乳动物的研究显示,hepcidin兼具机体铁平衡调节与抗菌功能。Hepcidin基因在进化上较为保守,从鱼类到哺乳类均有存在,研究者在多种鱼类发现hepcidin有多亚型现象。至今对鱼类有关hepcidin的研究尚不够系统、深入,尤其是不同亚型hepcidin的生物学功能及基因表达调控是否存在差异或生物学互补效应等有待阐明。弹涂鱼生态习性特别,具有两栖性,能够较好适应水生与陆生条件下不同氧供给状态,该种鱼生活于泥滩,接触各种病原体的机会多,推测其免疫机能较强。本文以大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)为对象,研究其hepcidin的基因结构、5'侧翼序列,分析其特异性转录调控元件,并初步研究hepcidin的转录调节与抑菌活性,为阐明鱼类hepcidin的生物学活性及基因表达调控提供资料。本研究克隆了大弹涂鱼Hepcidin基因家族的两个亚型,即bpHep-1和bpHep-2的cDNA全长及基因序列。推导bp Hep-1前多肽原有88aa,包含信号肽22aa,前肽40aa,成熟肽26aa;bpHep-2前多肽原也由88aa组成,包含信号肽24aa,前肽42aa,成熟肽22aa。两个亚型的成熟肽中都含有8个Cys可形成4对二硫键。分子系统学分析显示,基于鱼类Hepcidin的进化树(neighbor joining tree,NJ tree)拓扑结构与基于多个核基因对鱼类系统进化树的拓扑结构吻合,骨鳔鱼亚部鱼类Hepcidin以88%高支持率独立聚支,为真真骨鱼亚部(Euteleostei)的姐妹群。真真骨鱼亚部中,进化地位相对较低的原棘鳍总目(Protacanthopterygii)以72%的支持率独立聚支,为新真骨鱼类(Neoteleostei)的姐妹群。在新真骨鱼类中,多种鱼类中具有多个hepcidin亚型,总体上以低支持率聚为2支,命名为Neo1和Neo2。大弹涂鱼bpHep-1归于Neo1,在成熟肽的N端均含有较为保守推测与铁代谢调节有关的基序[Q-S/I-H-L/I-S/A],bp Hep-2归入所有hepcidin序列均无该基序的Neo2。bpHep-1及bpHep-2的基因均含3个外显子和2个内含子,Exon 1包含5’UTR、信号肽和部分前肽序列,前肽从Exon 1跨越Exon 2一直延伸到Exon 3,Exon 3包含部分的前肽编码序列及3’UTR。bp Hep-1 cDNA的全长序列为573bp,包含267bp的开放阅读框,位于一侧的152bp的5’UTR和另一侧的154bp的3’UTR。bp Hep-2 cDNA的全长序列为598bp,包含267bp的开放阅读框,位于一侧的76bp的5’UTR和另一侧的74bp的3’UTR。bp Hep-1和bpHep-2转录起始位点上游-25~-30bp都存在TATA框(TATA box)。通过在线生物信息学软件分析,bpHep-1在-1341bp/+152 bp启动子区域存在23个转录调控元件,bpHep-2启动子在-1870bp/+75区域存在37个转录调控元件。bpHep-1和bpHep-2都含有C/EBPalp、SP1、Oct-1、HNF-3、TBP、GR、W T1 I-K等转录因子结合位点,其中C/EBPalp已被证明是哺乳动物hepcidin的有效转录激活因子,HNF-3是肝和内脏基因表达的转录因子,推测这几个转录因子在hepcidin表达调控中起着重要的作用。bpHep-2启动子区域含有NF-κB结合位点,而bpHep-1无该位点,NF-κB是固有免疫因子的表达的信号通路,推测bpHep-2在固有免疫中发挥着的作用较bpHep-1更重要。利用半定量PCR和荧光定量PCR技术,检测bpHep-1和bpHep-2在大弹涂鱼肝、肠、鳃、头肾和小肠等组织中均有表达,特别是在肝组织中,其表达量远高于其他组织,并且肝组织bpHep-2的相对表达量显著高于bpHep-1。注射LPS、poly(I:C)、0.1mg/g右旋糖酐铁对bpHep-1和bpHep-2在各组织的表达没有显著影响,而0.5mg/g右旋糖酐铁刺激24h后,bp Hep-1基因在肠、头肾和脾组织中的表达量显著性上调,bpHep-2在鳃、肠、头肾和脾的组织中显著性上调。这提示两种亚型都可能参与了铁代谢的调节。应用pET-SUMO大肠杆菌表达载体,成功的将bp Hep-1和bpHep-2成熟肽基因片段连接至pET-SUMO载体,通过原核大肠杆菌BL21(DE3)表达出来的两个抗菌肽再通过抑菌实验对其生物活性验证,浓度为12.5μM的bp Hep-1和bpHep-2即对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的生长显示出抑制效应。综上所述,本研究在克隆弹涂鱼hepcidin两个基因亚型的的基础上,对推导的氨基酸序列进行了分子系统学分析,对基因侧翼序列进行了启动子及转录因子结合位点分析,为深入研究鱼类hepcidin的功能奠定了重要基础。研究了bp Hep-1和bpHep-2在弹涂鱼不同组织中的基础转录水平,并探究了在体内注射免疫刺激物LPS、PolyI:C以及不同剂量的Fe2+对bpHep-1和bpHep-2基因转录水平的影响,发现高剂量的Fe2+对两个亚型都具有上调作用,但呈组织特异性。此外,构建了pET-SUMO-bpHep-1和pET-SUMO-bpHep-2原核表达载体,并成功表达了bpHep-1和bpHep-2。
【图文】：

图1-1 Hepcidin参与调控铁稳态示意图（引自牛诗雯等[46]）注: A:铁过载时 B:铁不足时1.3.4 低氧对 Hepcidin 的表达研究表明，缺氧会影响机体对铁的吸收，当体内铁含量比较低时，Hepcidin的表达量将会减少。Nicolas 等在 2002 年首次报道了低氧条件下培养的 HepG2 细胞与在正常氧含量的情况下相比，其Hepcidin mRNA 表达水平明显降低[47]。但是关于低氧与Hepcidin表达降低的分子机制目前还不是很清楚。其中一种说法是，低氧主要是依靠缺氧诱导因子（HIFs）来抑制 hepcidin 的表达，HIFs与Hepcidin基因的上游调控区域结合从而使hepcidin表达降低[48]。在低氧的环境中，HIFs也会间接的影响促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）等基因的表达，从而间接的使 Hepcidin 的表达受到抑制[49]。1.4 大肠杆菌表达系统

bpHep-1 基因前部分序列约为 1542bp 和后部分序列约为 1416bp 的片段，bpHep-2 前部分序列约为 1793bp 和基因序列约为 796bp 的片段，，这与预期的结果一致。图2-1 大弹涂鱼肝脏基因组注:M.500-1,5000bpDNAladderMarker;1,2: 大弹涂鱼肝脏基因组DNA
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：2557409