蒺藜苜蓿E3泛素连接酶U-box基因克隆及表达分析

发布时间：2019-11-16 06:45

【摘要】：泛素化在植物生长和发育过程中起重要作用,E3泛素连接酶负责对靶蛋白特异性识别,其中U-box结构的E3泛素连接酶具有调控植物生长发育和免疫反应等功能,并在抗逆性方面发挥作用。目前,关于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未见报道。本研究从蒺藜苜蓿中克隆得到U-box(MtPUB4)基因,该基因cDNA全长2448bp,编码815个氨基酸,包括1个U-box结构(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5个ARM结构域,属于U-box/ARM类型E3泛素连接酶。构建原核表达载体pET-MtPUB4,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明在大肠杆菌中表达了MtPUB4蛋白。荧光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜蓿花中的表达量最高,在根中表达量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脱落酸诱导,随着诱导时间增加,表达量呈现出增长趋势。这些结果表明,MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生长发育和抗逆性中可能起到重要调节作用,但在低温胁迫中表达量稍微下降,变化不明显。本研究成功构建了pBI121-MtPUB4植物表达载体,为进一步转化拟南芥突变体Atpub4奠定了基础。
【图文】：

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度计检测，Ａ２６０／Ａ２８０值为１．８７７；Ａ２６０／Ａ２３０值为２．０５４，图１蒺藜苜蓿ＲＮＡ提取和ＭｔＰＵＢ４基因ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ．１ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＵ－ｂｏｘＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａＡ：ＲＮＡ提取ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ｂ：ＭｔＰＵＢ４基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物（１～３）ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＭｔＰＵＢ４ｇｅｎｅｂｙＲＴ－ＰＣＲ（１－３）；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．说明ＲＮＡ质量较好（图１Ａ）。将提取ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ第一链；以ｃＤＮＡ第一链为模板，以基因特异性引物进行ＰＣＲ扩增目的片段（图１Ｂ），利用ＤＮＡＭＡＮ拼接后的全长ｃＤＮＡ为２４４８ｂｐ。将该基因命名为ＭｔＰＵＢ４，ＮＣＢＩ登录号为ＸＰ＿０１３４６０３８８．１。２．２生物信息学分析２．２．１保守结构域运用Ｅｘｐａｓｙ网站ＳＭＡＲＴ程序对ＭｔＰＵＢ４基因编码的蛋白结构域分析，结果显示ＭｔＰＵＢ４蛋白２１５～２７８位氨基酸具有Ｕ－ｂｏｘ／ＡＥＭ家族所具备的典型Ｕ－ｂｏｘ结构，５１５～７６４位氨基酸具有典型的ＡＲＭ重复结构，，该基因属于Ｕ－ｂｏｘ家族的一员，其编码的Ｕ－ｂｏｘ保守氨基酸序列为ＦＣ－ＣＰＬＳＬＥＬＭＴＤＰＶＩＶＡＳＧＱＴＹＥＲＡＦＩＫＮＷＩＤＬＧＬＴＶＣＰＫＴＨＱＴＬＡＨＴＮＬＩＰＮＹＴＶＫＡＬＩＡＮＷ。运用ＮＣ－ＢＩ保守域在线

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ｒｅｌｉｓｔｅｄｂｅｌｏｗ；Ｂｌａｃｋｉｎｄｉｃａｔｅｓ１００％ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｐｉｎｋｉｎｄｉｃａｔｅｓ７５％ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｂｌｕｅｉｎｄｉｃａｔｅｓ５０％ｉｄｅｎｔｉｔｙ．图３蒺藜苜蓿Ｕ－ｂｏｘＥ３泛素蛋白ＭｔＰＵＢ４进化树分析Ｆｉｇ．３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＵ－ｂｏｘＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅＭｔＰＵＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ菌体在诱导后出现特异性条带，各个浓度对蛋白表达图４ＭｔＰＵＢ４基因在蒺藜苜蓿不同组织中的相对表达量Ｆｉｇ．４ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｔＰＵＢ４ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ影响不明显。该蛋白在９０ｋＤａ条带处，与预期结果８８．３６ｋＤａ相符（图６）。说明该蛋白在大肠杆菌中成功诱导，可用于进一步蛋白表达研究。２．６植物表达载体构建将植物表达载体ｐＢＩ１２１和克隆载体分别酶切，回收相应片段纯化连接、转化、挑取单菌落、提取质粒，构建ＭｔＰＵＢ４基因植物表达载体。经过ＢａｍＨＩ酶切鉴定，得到与预期大小一致的目的片段（图７）。鉴定为阳性的质粒送公司测序后拼接，与基因序列一致，说明成功构建植物表达ｐＢＩ１２１－ＭｔＰＵＢ４。６８ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６）Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７

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