基于高通量测序分析菊花花期芽变‘神马’的成花机制及优异基因挖掘

发布时间：2019-11-16 07:29

【摘要】：菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是典型的短日植物,其花芽分化和开花时间受光周期调控。目前对模式植物的开花调控路径研究较为清楚,对菊花的成花分子机制了解较少。本研究发现菊花'低温神马'(M)在短日照条件下(SD)比'神马'(WT)提前一周左右开花,并且能够在长日条件下(LD)能够形成花蕾。经过序列相关扩增多态性分子标记(SRAP)鉴定确定其为'神马'的芽变材料。本研究试图通过对上述两种材料在不同光周期条件下花芽分化的样品进行转录组测序分析,研究该芽变材料的开花分子机制并挖掘优异基因。主要研究结果和结论如下:1.通过RNA-seq数据分析,发现'低温神马'的开花调控路径。构建了 4个转录组cDNA文库,'低温神马,-长日照(M-LD)、'神马'-长日照(WT-LD)、'低温神马'-短日照(M-SD)和'神马'-短日照(WT-SD)。通过对4个cDNA文库进行聚类分析,我们挖掘到许多差异转录基因(DTGs),涉及到光周期途径、年龄途径、环境温度途径和自主途径。在短日照条件下,两个材料中与昼夜节律钟相关的基因及CmFTL3显著上调,诱导花芽分化和开花;赤霉素信号途径的主要调控基因GA2ox、GA20ox和GID1的转录水平也发生显著差异。在长日照条件下,'低温神马,中GA20ox和GID1表达水平显著上调,GA2ox表达下调,从而诱导CmFTL1、CmFTL3和SOC1表达量增加,促进花芽分化和开花;并且'低温神马'的内源GA含量显著高于'神马',外源GA处理后,'神马'的表型与'低温神马'相似。以上结果表明,长日条件下,GA在'低温神马'的成花过程起重要调控作用,能够促进花芽分化。我们的研究表明,光周期途径和赤霉素途径共同调控菊花短日条件下的开花时间,其中赤霉素信号是一条辅助路径。但是,在长日条件下,赤霉素信号路径在花芽分化和开花中起主要作用。2.CmEMF2基因的克隆与功能分析。对DTGs进行聚类分析,发现除了光周期路径和赤霉素信号路径的关键基因,其他开花相关的重要基因,包括:AP1、EMF、SVP SPL、FRI等,均发生显著的转录差异。鉴于EMFs的功能在菊花中尚不清楚,本试验利用PCR等技术验证了菊花'神马'中两个EMF2基因的开放阅读框(ORF)序列,二者均含有VEFS-box保守结构域,其中CmEMF2.1的ORF编码627个氨基酸残基,CmEMF2.2的ORF编码616个氨基酸残基,二者相似度为58.65%。蛋白序列比对和系统进化树分析表明,CmEMF2.1和CmEMF2.2蛋白与菜蓟(Cynara cardunculus var.scolymus)的相似性最高,遗传距离也最近。亚细胞定位分析结果显示CmEMF2.1定位于细胞核。荧光定量结果表明,菊花中两个CmEMF基因的表达具有组织特异性,均在叶片中表达量最高。在营养生长阶段,CmEMFs的表达量随植株生长而增加,在花芽分化前达到峰值,花芽分化完成后,表达水平下降,但仍有一定的表达水平。我们猜测,CmEMFs能够促进菊花的营养生长,抑制生殖生长,而且参与菊花的花器官发育。另外,CmEMF2.1能够响应光周期信号,在光照下表达量减少,在黑暗中表达量增加,猜测与不同光照下的转录活性有关。3.农杆菌介导的菊花叶片瞬时转化再生体系的构建。本研究通过农杆菌介导的瞬时转化法将含有GUS基因的表达载体pORE R1-2×35S:GUS转入菊花'优香,叶片,经过外植体消毒和组织培养获得稳定遗传的阳性再生植株,转化率为38.9%,远远高于传统的农杆菌侵染转化法,为菊花提供了一种新的高效的转基因方法。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S682.11

【参考文献】