大熊猫和四川黑熊BANF1基因的克

发布时间：2020-02-08 15:09

【摘要】：大熊猫(学名:Ailuropoda melanoleuca),又被人称为“活化石”,是一种只发现于中国的珍贵物种,它的分布范围包括四川西北、陕西西南、西藏东部和甘肃南部。喜食箭竹,也爱吃蜂蜜。其极低的繁殖率,导致个体数量少,我国把它列为一级保护动物。四川黑熊(学名:Ursus thibetanus mupinensis),名字还包括月熊、藏熊等,它采食的食物种类多样,喜欢吃幼嫩叶子和真菌。亚洲南部温暖地区是它的活动地带,因为人类的过度捕猎行为,我国把它确定为国家二级重点保护野生动物,同时纳入中国濒危动物红皮书。综合来看两个物种都有特别的研究价值。本研究根据人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos Taurus)、黑猩猩(Pan troglodytes)五种哺乳动物物种已知的mRNA序列为参考来设计引物;实验材料是大熊猫和四川黑熊骨骼肌,再分别从材料中提取出总RNA和基因组DNA;然后采用反转录PCR、降落PCR(Touch-down PCR)技术分别进行两个物种BANF1的表达序列和结构基因序列的扩增与克隆;把产物外送测序,并使用分析软件对得到的结果进行比较、分析;分别构建了大熊猫和四川黑熊的BANF1cDNA的重组表达载体,然后将载体转化进E.coli-BL21,进行IPTG诱导表达。本实验给其他与大熊猫和四川黑熊的基因相关的研究提供了具体的方法和实验经验。实验结果显示:从大熊猫和四川黑熊克隆得到的BANF1的cDNA序列有297个碱基,含有一个270 bp编码89个氨基酸的开放阅读框。大熊猫基因组序列长度为521 bp,四川黑熊为536 bp,都拥有2个外显子。经过软件分析得出,BANF1基因的核苷酸序列、氨基酸序列的保守性比较高,这一点有一定的借鉴意义。将大熊猫分别与四川黑熊、人、小家鼠、褐家鼠、牛和黑猩猩6个物种的BANF1基因的编码序列及其所编码的氨基酸序列进行相似性比较,结果显示编码序列相似性分别为98.15%,96.6%,93.3%,93.03%,96.6%和96.6%;而氨基酸序列的相似性分别为96.63%,93.7%,92.6%,91.5%,91.1%和93.7%。把四川黑熊分别与人、小家鼠、褐家鼠、牛和黑猩猩5个物种的BANF1基因的编码序列及其所编码的氨基酸序列进行相似性比较,结果显示编码序列相似性分别为95.19%,94.10%,93.33%,92.96%和95.56%;而氨基酸序列的相似性分别为100%,96.63%,96.63%,100%和100%。拓扑预测显示大熊猫和四川黑熊的BANF1蛋白同时含有一个蛋白激酶C磷酸化位点,一个酰胺化位点,一个酪氨酸激酶磷酸化位点,一个N-肉豆蔻酰化位点;此外,大熊猫独有一个酪蛋白激酶II磷酸化位点。使用感受态细胞BL21进行目的蛋白的诱导表达,结果表明,BANF1蛋白含有N-末端His-标记的预期的14 kDa的多肽,累积于包涵体内。目的蛋白经过分离纯化后,可以用于其他实验安排。
【图文】：

电泳图,电泳图,亮度,实验结果

第 3 章实验结果、分析与讨论第 3 章实验结果、分析与讨论3.1 实验结果3.1.1 总 RNA 和基因组 DNA 的提取结果（图 3-1）使用浓度为 1.0%的 Agarose 进行电泳检测总 RNA，用 0.6%的 Agarose 进因组 DNA 提取检测，图 3-1（a）所示，28S RNA 条带的亮度约为 18S RNA 条亮度的两倍，表明总 RNA 质量较好，可以进行后续试验；3-1（b）图所示，组 DNA 没有明显降解迹象，可以进行后续实验。

空白图,结构基因,迹象,空白

图 3-1（a）所示，28S RNA 条带的亮度倍，表明总 RNA 质量较好，，可以进行后续试验；3-有明显降解迹象，可以进行后续实验。图 3-1 总 RNA(a)和 DNA（b）提取电泳图Fig. 3-1 Results of total RNAs (a) and DNA (b) extraANF1 cDNA RT-PCR 和结构基因 PCR 结果（图 3-2 ）
【学位授予单位】：西华师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q953

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