人参可溶性焦磷酸酶基因PgPpase03-1的表达分析及转化番茄研究
发布时间：2020-03-23 07:59
【摘要】：本研究利用实验室已有的吉林人参(Panax ginseng C.A.Meyer)248,993个unigenes转录组数据库,通过生物信息学方法挖掘及分析吉林人参可溶性焦磷酸酶基因(PgPpase)。预测可能对人参皂苷生物合成产生影响的PgPpase基因,并将PgPpase03-1基因与人参皂苷合成关键酶基因一同进行表达分析,佐证生物信息学预测的准确性,并以番茄为受体材料进行遗传转化,主要研究结果如下:1.筛选到126条PgPpase基因,其中25条具有完整开放阅读框和保守结构域,经合并得到7个基因ID下的14条PgPpase基因,共预测到10个保守基序。2.系统进化树分为三大分支。其中PgPpase01-1、PgPpase07-1、PgPpase06-1、PgPpase06-5基因与海洋真核微藻(Ostreococcus tauri)、超微藻(Bathycoccus prasinos)和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中Ppase基因聚集在一个分支上,表明这几条PgPpase在人参中出现较早。3.表达量分析表明PgPpase02-3、PgPpase02-6、PgPpase03-1、PgPpase06-1和PgPpase06-5基因在任何组织、年生和农家品种中都有较高表达量,其中PgPpase03-1基因的表达量最高。4.预测可能对人参皂苷合成产生影响的基因,得出PgPpase03-1基因最具有进一步研究价值。5.PgPpase03-1基因的表达分析结果表明,不同激素处理下PgPpase03-1基因和关键酶基因均极显著上调表达,同时人参皂苷含量升高,佐证了生物信息学预测的准确性。6.以番茄为受体进行遗传转化,胚轴转化率为5.7%-8.2%,子叶转化率为11.0%-14.1%,获得34株阳性番茄植株的T0代种子。
【图文】：
水的三角形结构[15]。Tuominen 等在 2007 年，又发现了另一个具有复杂组成的亚家族即含有 CBS 结构域的 S-PpaseⅡ(CBS-Ppase)[16]。大约四分之一的 S-PpaseⅡ中会含有由两个 CBS 结构域组成的调节肽段，或还会有 DRTGG 结构域(由保守的 Asp-Arg 和 Thr-Gly-Gly 基序而得名)插入到其中的一个 CBS 结构域中的现象(如图 2)[16]。根据所有 CBS-Ppase 和典型 S-PpaseⅡ的结构域的序列相似性和所有活性位点残基的保守性，模拟产气荚膜梭菌的 CBS-Ppase 全序列对应的完整结构，结果表明，此酶的催化部分和活性部分在空间上是相互独立的，这就与它们分别存在但是都具有功能的事实相符合[17]。S-PpaseⅢ是卤素脱氢酶的变体，卤素脱氢酶 motifⅠ[DXDX(T/V)]中的第二个 Asp 被 Trp 代替，，motifⅡ中的 Thr/Ser被 Gly 替代就产生了 S-Ppase Ⅲ[6]。
水解焦磷酸的速率常数大约为 200 s-1；S-PpaseⅡ中的典型 S-PpaseⅡ水解焦磷酸的速率常数大约为 104s-1，是所有类型的 S-Ppase 中催化活性最强的；S-Ppase Ⅲ；虽然能催化 PPi，但是速率常数大约却只有 0.2 s-1。S-PpaseⅡ中的 CBS-Ppase 因含有调控插入片段而具备了自抑调控能力，所以催化活性比典型的 S-PpaseⅡ下降了 1-3 个数量级[20]。S-PpaseⅠ和 S-PpaseⅡ都需要 3 或 4 个二价金属阳离子(通常为 Ca2+和 Mg2+)来辅助其完成催化作用，然而 S-PpaseⅡ还需要过渡金属离子(如 Mn2、Co2+和 Ni2+)作为第二辅助因子参与催化过程才能达到最大活性[21]。研究表明 CBS-Ppase 更倾向于 Co2+作为第二辅助金属离子[15,22]。S-Ppase Ⅲ同样需要过度金属离子作为第二辅助因子，在 pH 为 6，Ni2+存在时其达到最大活性[6]。S-PpaseⅠ还可以选择性的催化 ATP 中的磷酸基团水解释放能量，当过渡金属离子的浓度达到镁离子辅助 S-PpaseⅠ发挥功能的浓度的 1%时，就能催化 ATP 水解[23]，但是 S-PpaseⅡ在任何情况下，都不能催化 ATP 的水解[13]；相反 S-PpaseⅡ能催化三磷酸盐和亚胺二磷酸盐水解，催化速率比催化焦磷酸的速率低 104-105倍，但是 S-PpaseⅠ却不能水解三磷酸盐和亚胺二磷酸盐[24]。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S567.51
本文编号：2596437
【图文】：
水的三角形结构[15]。Tuominen 等在 2007 年，又发现了另一个具有复杂组成的亚家族即含有 CBS 结构域的 S-PpaseⅡ(CBS-Ppase)[16]。大约四分之一的 S-PpaseⅡ中会含有由两个 CBS 结构域组成的调节肽段，或还会有 DRTGG 结构域(由保守的 Asp-Arg 和 Thr-Gly-Gly 基序而得名)插入到其中的一个 CBS 结构域中的现象(如图 2)[16]。根据所有 CBS-Ppase 和典型 S-PpaseⅡ的结构域的序列相似性和所有活性位点残基的保守性，模拟产气荚膜梭菌的 CBS-Ppase 全序列对应的完整结构，结果表明，此酶的催化部分和活性部分在空间上是相互独立的，这就与它们分别存在但是都具有功能的事实相符合[17]。S-PpaseⅢ是卤素脱氢酶的变体，卤素脱氢酶 motifⅠ[DXDX(T/V)]中的第二个 Asp 被 Trp 代替，，motifⅡ中的 Thr/Ser被 Gly 替代就产生了 S-Ppase Ⅲ[6]。
水解焦磷酸的速率常数大约为 200 s-1；S-PpaseⅡ中的典型 S-PpaseⅡ水解焦磷酸的速率常数大约为 104s-1，是所有类型的 S-Ppase 中催化活性最强的；S-Ppase Ⅲ；虽然能催化 PPi，但是速率常数大约却只有 0.2 s-1。S-PpaseⅡ中的 CBS-Ppase 因含有调控插入片段而具备了自抑调控能力，所以催化活性比典型的 S-PpaseⅡ下降了 1-3 个数量级[20]。S-PpaseⅠ和 S-PpaseⅡ都需要 3 或 4 个二价金属阳离子(通常为 Ca2+和 Mg2+)来辅助其完成催化作用，然而 S-PpaseⅡ还需要过渡金属离子(如 Mn2、Co2+和 Ni2+)作为第二辅助因子参与催化过程才能达到最大活性[21]。研究表明 CBS-Ppase 更倾向于 Co2+作为第二辅助金属离子[15,22]。S-Ppase Ⅲ同样需要过度金属离子作为第二辅助因子，在 pH 为 6，Ni2+存在时其达到最大活性[6]。S-PpaseⅠ还可以选择性的催化 ATP 中的磷酸基团水解释放能量，当过渡金属离子的浓度达到镁离子辅助 S-PpaseⅠ发挥功能的浓度的 1%时，就能催化 ATP 水解[23]，但是 S-PpaseⅡ在任何情况下，都不能催化 ATP 的水解[13]；相反 S-PpaseⅡ能催化三磷酸盐和亚胺二磷酸盐水解，催化速率比催化焦磷酸的速率低 104-105倍，但是 S-PpaseⅠ却不能水解三磷酸盐和亚胺二磷酸盐[24]。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S567.51
【参考文献】
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本文编号：2596437
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