马尾松PmSnRK2s基因的克隆与功能分析
发布时间：2020-03-23 08:23
【摘要】：马尾松是我国特有、分布面积最广的针叶树种,用途广泛,在经济和生态上均具有重要的价值。该树种具有良好的抗性,尤其以抗瘠薄见长,但至今有关马尾松抗旱机制方面的研究却鲜见报道。本论文主要研究了在植物抗旱性能方面起着重要作用的SnRK2基因家族的PmSnRK2.3、PmSnRK2.6a和PmSnRK2.6b三个基因,结果如下:(1)借助同源克隆技术和末端快速扩增技术(RACE)获得三个基因(PmSnRK2.3、PmSnRK2.6a和PmSnRK2.6b)的完整cDNA序列,长度分别为2356bp、2059bp和1760bp,分别编码了362、356和362个氨基酸。通过对三个基因编码的蛋白质分别进行理化性质的分析与预测,结果显示:PmSnRK2.3蛋白分子式为C_(1812)H_(2825)N_(495)O_(550)S_(16),分子量为40857.31Da;PmSnRK2.6a蛋白分子式为C_(1772)H_(2773)N_(481)O_(545)S_(16),分子量为40048.37Da;PmSnRK2.6b蛋白分子式为C_(1794)H_(2788)N_(488)O_(559)S_(21),分子量为40810.07Da;PmSnRK2.6b为不稳定亲水蛋白,其余两者均为稳定亲水蛋白。(2)以成年马尾松的各部位组织为材料进行实时荧光定量表达分析得出:PmSnRK2.3表达量最低的部位是新茎,表达量最高的部位是花,花中该基因的表达量约为老叶的1.34倍;PmSnRK2.6a表达量最低的部位是老茎,表达量最高的部位是花,花中该基因的表达量约为老叶的4.5倍;PmSnRK2.6b表达量最低的部位也是老茎,表达量最高的部位同样是花,花中该基因的表达量约为老叶的2.9倍。结果显示PmSnRK2.3、PmSnRK2.6a和PmSnRK2.6b三个基因在成年马尾松各部位组织中均呈现不同程度的表达,其中花中的表达量最高,而茎则为表达量较低的组织。将30d的完整马尾松幼苗,分别水培于10%pEG6000和ABA溶液中,取0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h和24h时间点的幼苗为材料,进行实时定量荧光分析表达得出:PEG6000处理下,在2h和24h时均出现波峰,表达量最高时约为0h的2.3倍,最低约为0h的1.1倍。ABA处理下,在1h和24h时均出现波峰,表达量最高是约为0h的2.8倍,最低时约为0h的1倍。(3)通过同源重组的方法构建了PmSnRK2.3的GUS融合表达载体,借助农杆菌侵烟草的叶盘,获得转基因株系。通过基因组PCR检测、GUS染色、表型分析、干旱模拟和生理指标测定等方法,分析野生型烟草与转基因烟草的差异。干旱处理后,无论是植株的生长势、叶片、根系等表型,还是生理指标测定分析,结果均显示转基因烟草的抗旱性能均强于对照组。本论文研究结果可为马尾松抗旱机制的揭示、抗性基因的挖掘利用提供帮助。
【图文】：
酸化水平[30]。AMPK 在高 AMP/ATP 的状态下被 AMP 激活，也受到上游蛋白激酶AMP-activated protein kinase (AMPKK)的刺激而激活。经过实验探究得到结论：显示在面对逆境胁迫时，哺乳动物细胞中所存在的活化 AMPK 是作出相应响应的启动原件[31]。与前两者不同的是，SnRK 广泛存在于植物体中，在结构上具有保守性，并且根据基因家族成员的蛋白质结构的特点可以将其分为SnRK1、SnRK2和SnRK3三个亚家族[32]。其中，SnRK1亚家族与超家族中的 SNF1 和 AMPK 两大家族在结构上具有一定的同源性，功能上也存在着相似性；SnRK2 和 SnRK3 则与之相反，并且仅存在于植物体中。研究报道指出，SnRK 蛋白激酶家族成员的 N 端存在特含一个苏氨酸的激酶结构域，该区域可进行自我调节并具有较高的变化性。SnRK 蛋白激酶包括三个亚家族，每一个亚家族的结构特点各不相同，在功能上也有所差异[33]。三个亚家族均具有三个子结构，，一端是存在 Ser/Thr 这一蛋白激酶区域的结合域，另一端是一段可以进行自我调节或者自我抑制的序列[34]，中间片段衔接结合域和自我调节序列，具有调整异源三聚体复合体的形状[35](图 1.1)。
已知某酵母突变体中的 SNF1 无法正常表达，往该突变体中转入黑麦的 SnRK1 基因并之表达。结果显示，突变体 SNF1 执行的功能得到恢复，即参与调控编码糖代谢相关酶的基因可正常运作。并且，转基因的酵母可利用乙醇和甘油等非发酵碳源[37]。在酵母突体中表达烟草 NtNPK5 基因，并将转基因的突变体培养在含蔗糖的培养基上，发现该突体可以正常生长并含有转化酶活性[39]。由此判断植物的糖代谢机制可能与酵母类似，而nRK1 起到的信号传导功能也与 SNF1 类似。而 NtNPK5 基因恢复 SNF1 酵母突变体正常长与葡萄糖调节路径有关，进一步验证了植物与酵母在糖信号传导调节机制具有较高的似性[36]。在马铃薯块茎中反义表达 SnRK1 基因，发现蔗糖合成酶基因的表达量和活性均现明显下降的情况，而转基因植株的叶片中，蔗糖含量增加，蔗糖合成酶基因的表达量不再随之上升[40]。因此可以得出结论：SnRK1 对糖代谢的调控是通过直接参与蔗糖合成基因的表达调控来实现的(图 1.2)。
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S791.248
本文编号：2596459
【图文】：
酸化水平[30]。AMPK 在高 AMP/ATP 的状态下被 AMP 激活，也受到上游蛋白激酶AMP-activated protein kinase (AMPKK)的刺激而激活。经过实验探究得到结论：显示在面对逆境胁迫时，哺乳动物细胞中所存在的活化 AMPK 是作出相应响应的启动原件[31]。与前两者不同的是，SnRK 广泛存在于植物体中，在结构上具有保守性，并且根据基因家族成员的蛋白质结构的特点可以将其分为SnRK1、SnRK2和SnRK3三个亚家族[32]。其中，SnRK1亚家族与超家族中的 SNF1 和 AMPK 两大家族在结构上具有一定的同源性，功能上也存在着相似性；SnRK2 和 SnRK3 则与之相反，并且仅存在于植物体中。研究报道指出，SnRK 蛋白激酶家族成员的 N 端存在特含一个苏氨酸的激酶结构域，该区域可进行自我调节并具有较高的变化性。SnRK 蛋白激酶包括三个亚家族，每一个亚家族的结构特点各不相同，在功能上也有所差异[33]。三个亚家族均具有三个子结构，，一端是存在 Ser/Thr 这一蛋白激酶区域的结合域，另一端是一段可以进行自我调节或者自我抑制的序列[34]，中间片段衔接结合域和自我调节序列，具有调整异源三聚体复合体的形状[35](图 1.1)。
已知某酵母突变体中的 SNF1 无法正常表达，往该突变体中转入黑麦的 SnRK1 基因并之表达。结果显示，突变体 SNF1 执行的功能得到恢复，即参与调控编码糖代谢相关酶的基因可正常运作。并且，转基因的酵母可利用乙醇和甘油等非发酵碳源[37]。在酵母突体中表达烟草 NtNPK5 基因，并将转基因的突变体培养在含蔗糖的培养基上，发现该突体可以正常生长并含有转化酶活性[39]。由此判断植物的糖代谢机制可能与酵母类似，而nRK1 起到的信号传导功能也与 SNF1 类似。而 NtNPK5 基因恢复 SNF1 酵母突变体正常长与葡萄糖调节路径有关，进一步验证了植物与酵母在糖信号传导调节机制具有较高的似性[36]。在马铃薯块茎中反义表达 SnRK1 基因，发现蔗糖合成酶基因的表达量和活性均现明显下降的情况，而转基因植株的叶片中，蔗糖含量增加，蔗糖合成酶基因的表达量不再随之上升[40]。因此可以得出结论：SnRK1 对糖代谢的调控是通过直接参与蔗糖合成基因的表达调控来实现的(图 1.2)。
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S791.248
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1 韦蔷;马尾松PmSnRK2s基因的克隆与功能分析[D];南京林业大学;2018年
本文编号：2596459
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