桃小食心虫性信息素结合蛋白基因的克隆及功能鉴定

发布时间：2020-03-24 18:04

【摘要】：桃小食心虫是我国北方果树生产中发生与危害最为广泛的食心虫类害虫之一,由于具有分布广、隐蔽性强、自然天敌少等特点难以防治。生产中主要通过化学农药等措施来控制其为害,但在综合防治措施中,由于性诱剂等引诱剂具有高效、专一性、不伤害益虫、不污染环境等优点,被广泛应用。性信息素和寄主挥发物在害虫的引诱过程中扮演着重要的角色,昆虫利用其灵敏的嗅觉系统定位寄主食物和栖息场所、探求配偶、交配并产卵、躲避天敌等,而寄主挥发物与性信息素的结合使用能够显著增强引诱剂的效果。因此,本文对桃小食心虫的嗅觉相关蛋白展开研究,并着重调查在雌雄之间的差异基因,从而为进一步开发高效的桃小食心虫性诱剂、控制其种群数量奠定理论基础。首先对桃小食心虫雌雄触角进行了二代转录组测序,通过同源比对等生物信息学方法等注释并鉴定了嗅觉基因家族,然后着重研究了性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)和普通气味结合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs)的表达模式和功能。主要研究结果如下:1.桃小食心虫触角转录组测序及嗅觉基因的鉴定本研究使用Illumina HiSeq4000平台对桃小食心虫雌雄触角进行了转录组测序,并通过生物信息学对嗅觉识别相关基因进行鉴定,共鉴定了 29个OBPs基因、13个CSPs和52个气味受体基因(包括1个Orco)。OBPs的氨基酸多重序列比对结果表明其中19个具有OBPs的典型特征。另外,除了 5个OBPs(OBP1、OBP4、OBP9、OBP20、OBP22)外,其余OBPs均具有信号肽。进化树分析结果表明,桃小食心虫的GOBP3聚到了 GOBP1亚家族,而进一步同源矩阵分析发现GOBP3与其他昆虫的GOBP1有较高的一致性,平均一致性为65.2%,表明GOBP3可能与GOBP1有着类似的生物功能;荧光定量结果显示OBP7特异性地在雌雄触角中表达,表明其可能在桃小识别性信息素、定位寄主植物和寻找合适产卵位点的过程中发挥重要作用;而其余OBPs(OBP7、OBP9、OBP12、OBP15、OBP19、GOBP1、GOBP3、PBP2)除了在触角中高表达外,在其他组织中也有表达。本研究所鉴定的13个CSPs均有CSPs序列motif(C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4),即具有4个保守的半胱氨酸。另外,信号肽预测发现13个CSPs均具有完整的ORF,且均编码信号肽序列。荧光定量结果表明在我们鉴定的3个CSPs(CSP1、CSP5、CSP12)中只有CSP5在触角中特异性高表达,表明CSP5可能在桃小嗅觉识别过程中发挥关键作用;值得注意的是CSP1和CSP12均在雄虫的腹中高表达,表明其可能在桃小的生长发育中发挥重要功能。对受体基因的跨膜结构域分析结果显示52个ORs的跨膜结构为2-7个,信号肽预测发现其均为信号肽结构。荧光定量检测了 14个ORs(OR3、OR4、OR8、OR17、OR21、OR24、OR30、OR31、OR33、OR34、OR41、OR46、OR48、OR49)的表达谱,结果表明ORs不仅在触角中高表达,在其它组织中也有表达。其中9个ORs(OR4、OR17、OR21、OR24、OR34、OR46、OR48、OR49、GR8)在雌虫触角中的表达量显著高于雄虫触角中,表明这几个基因对桃小雌蛾定位寄主植物和寻找产卵位点的过程有着重要作用;4个ORs(OR8、OR30、OR31、OR33)在雄虫触角中显著性高表达,表明其可能在识别性信息素过程中起关键作用。2.PBPs和GOBPs基因的分子克隆及功能分析首先通过RACE-PCR分子克隆得到PBPs和GOBPs基因,同时qRT-PCR转录水平和western蛋白水平检测结果表明,PBPs和GOBPs基因在桃小雄虫触角中的表达量均显著高于雌虫。荧光竞争结合实验结果表明,CsasPBP1和CsasPBP3主要识别Z-7-二十碳烯-11-酮,而CsasPBP2则主要负责识别Z-7-十九碳烯-11-酮,而除GOBP2外其余4个蛋白均与桃小的2种性信息素组分(Z-7-eicosene-11-one 和 Z-7-nonadecene-11-one)具有很强的结合能力,而只有 CsasPBP3 特异性地结合性信息素成分,CsasPBP1-2能够与众多的苹果挥发物发生结合;GOBP1-2可以与寄主挥发物发生特异性结合。值得注意的是它们均与酯类化合物和烯类化合物有较强的结合能力,进一步分析发现这5个蛋白与6-7个碳原子的化合物结合力较弱。这表明碳链上的不饱和双键存在以及碳链的长度与否显著地影响了化合物分子与蛋白的结合能力。
【图文】：

识别机制,昆虫嗅觉,气味结合蛋白,嗅觉反应

图丨－１昆虫的嗅觉反应及识别机制（Ｚｈｏｕ，邋２０１０）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ｉｎｓｅｃｔ邋ｏｌｆａｃｔｉｏｎ邋（Ｚｈｏｕ，邋２０１０）逡逑１．４昆虫嗅觉相关蛋白研究进展逡逑１．４．１气味结合蛋白逡逑普通气味结合蛋白（Ｇｅｎｅｒａｌ邋Ｏｄｏｒａｎｔ邋Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＧＯＢＰｓ）和性信息素结合蛋

氨基酸序列,触角,雌雄,基因

味结合蛋白（０ＢＰ９、ＯＢＰ１５、０ＢＰ２１，Ｇ０ＢＰ１和ＰＢＰ２）均在雄性触角中显著性表达，，而２个气逡逑味结合蛋白（０ＢＰ７和ＯＢＰ１９）雌性触角显著表达（图２－３Ａ）；邋ＣＳＰｓ、ＳＮＭＰｓ和ＧＲｓ的分析结逡逑果表明均只有一个基因在雌雄触角中显著性表达，分别为ＣＳＰ１２、ＳＮＭＰ２和ＧＲ８邋（图２－３Ｂ－Ｃ）。逡逑在ＯＲｓ的分析结果中发现ＯＲ２（Ｏｒｃｏ）在ｍＲＮＡ水平有着极高的表达，并且在雌雄触角中的表达逡逑量相当；另外，有３个ＯＲｓ邋（０Ｒ３１、ＯＲ３３和０Ｒ４１）在雄性触角中显著表达，然而有８个ＯＲｓ逡逑（０Ｒ４、ＯＲ１７、ＯＲ２４、ＯＲ３０、ＯＲ３４、ＯＲ４６、ＯＲ４８邋和邋ＯＲ４９）呈现出与以上相反的结果（图逡逑２－３Ｄ）。而在我们所鉴定的所有嗅觉基因中，８个ＩＲｓ中均在雌雄触角无显著性差异（图２－３Ｅ）；逡逑最后，我们发现在所有鉴定的候选基因中，ＧＲｓ的相对表达量最低（最大ＦＰＫＭ值＜４）。逡逑２．２．４气味结合蛋白基因的鉴定及纟且织表达量分析逡逑在桃小食心虫的触角转录组中，共鉴别并注释了邋２９个ＯＢＰｓ基因（包括２个ＧＯＢＰｓ和３个逡逑ＰＢＰｓ），其中除ＯＢＰ１和ＯＢＰ２３外，其余ＯＢＰｓ均具有完整的开放阅读框ＯＲＦ，信号肽预测结果逡逑表明有５个ＯＢＰｓ邋（ＯＢＰ１、ＯＢＰ４、０ＢＰ９、ＯＢＰ２０和ＯＢＰ２２）不具有信号肽结构（表２－４）。根逡逑据ＯＢＰｓ蛋白的序列特征并与在其他淲翅目昆虫己鉴定的ＯＢＰｓ氨基酸序列进行序列比对，我们逡逑发现共有１９个ＯＢＰｓ属于典型ＯＢＰｓ家族（图２－４）
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433

【参考文献】