苦参功能基因RPS13s和HSP17.8的克

发布时间：2020-03-27 05:58

【摘要】：苦参为清热燥湿的传统中药材,其主要化学活性成分:苦参碱、氧化苦参碱和黄酮类已呈现较好的临床应用前景,现今广泛用于临床治疗慢性病毒性肝炎、女性阴道炎症及人类各种癌症。已知核糖体蛋白和热应激蛋白分别对维持植物的正常生命活动和减轻逆境胁迫引起的伤害有着非常重要的作用,因此本实验对苦参核糖体蛋白S13(Ribosomal Protein S13,RPS13)和热应激蛋白(Heat Shock Protein,HSP)HSP17.8进行了克隆、体外表达并分析了这些蛋白的理化性质、结构特点及生物学功能。目的:克隆常用中药苦参中重要的功能基因:RPS13基因和HSP17.8基因,并在体外诱导其表达相应的目的蛋白,系统地分析目的蛋白的物理化学性质、二级结构、三级结构等生物学信息,初步探讨苦参这两类蛋白的结构和功能。方法:基于苦参转录组分析获得的Unigene数据,利用Primer Premier 5.0软件设计特异性扩增引物,提取苦参总RNA并用酶标仪和1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度和完整性。利用RT-PCR法对RPS13基因和HSP17.8基因的开放阅读框进行扩增,将扩增片段与pMD19-T Vector进行连接,用双酶切法(Nde I/Xho I)、菌液PCR法及测序法对重组质粒进行验证。将双酶切后回收的扩增片段与pET22b(+)Vector进行连接,同样用双酶切法(Nde I/Xho I)、菌液PCR法及测序法对重组质粒进行鉴定。系统地对RPS13和HSP17.8进行生物学信息分析,目的蛋白用不同浓度的IPTG诱导剂在不同温度、时间下诱导,最后用western blot分析苦参RPS13和HSP17.8的表达水平。结果:(1)总RNA提取结果:OD_(260nm)/OD_(280nm)比值为1.92、1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示RNA的28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA三个条带均清晰可见。(2)RT-PCR实验结果为:三个RPS13 PCR结果显示在分子量为500 bp左右出现明亮条带(理论分子量为456 bp);同样地,HSP17.8 PCR结果显示在分子量为500 bp左右出现明亮条带(理论分子量为501 bp)。(3)双酶切(Nde I/Xho I)、菌液PCR及测序结果:三个RPS13双酶切结果和菌液PCR结果显示在分子量为500 bp左右处均出现清楚的目的条带,测序结果用DNAssist软件比对发现与原来转录组数据里的序列一致;同样地HSP17.8的双酶切结果和菌液PCR结果也显示在分子量为500 bp左右处均出现清楚的目的条带,测序结果用DNAssist软件比对发现也与原来转录组数据里的序列一致。(4)重组表达载体构建后,双酶切(Nde I/Xho I)、菌液PCR及测序结果正确。(5)生物信息学分析结果显示:三个RPS13均属于不稳定蛋白,理论分子量约为17.2 KD,苦参与油棕树的RPS13亲缘关系最近,三级结构预测表明苦参三个RPS13蛋白的N末端有4个α螺旋,C末端有3个α螺旋,这两簇α螺旋通过长的无规卷曲连接。HSP17.8属于稳定蛋白,理论分子量约为17.8 KD,苦参与羽扇豆的HSP17.8的亲缘关系最近,三级结构预测表明苦参HSP17.8的4个α螺旋和5个β折叠形成了β1-α1-β2-α2-β3-α3-β4-α4-β5的折叠方式,5个β折叠相同方向,被α螺旋包裹在内部,构成了蛋白质立体结构的内部框架。(6)Western blot技术检测苦参RPS13和HSP17.8的表达水平,结果显示:16℃、0.5 mmol/L IPTG,24 h为RPS13-1的最佳表达条件;25℃、1 mmol/L IPTG,8 h为RPS13-2的最佳表达条件;25℃、0.1 mmol/L IPTG,8 h为RPS13-3的最佳表达条件;25℃、0.5 mmol/L IPTG,8 h为HSP17.8的最佳表达条件。结论:本研究首次从苦参中成功克隆RPS13s和HSP17.8基因开放阅读框,并在体外得到了表达。分析了RPS13s和HSP17.8的理化性质、进化关系、二级和三级结构特点,为进一步研究该蛋白的结构、功能奠定了实验基础。
【图文】：

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：总 RNA 琼脂糖凝胶电Fig 1. Total RNA isolatio增结果板，表 1 中的序列为碱基，以便更好的和克R 扩增，PCR 反应体结果如图 2 所示，三了预期大小的 RPS13

序列,琼脂糖凝胶电泳,苦参,条带

图 1：总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图Fig 1. Total RNA isolation.2 三个 RPS13 基因扩增结果以合成的苦参 cDNA 为模板，，表 1 中的序列为引物，用 rTaq 为 DNA 聚个RPS13基因末端带上A碱基，以便更好的和克隆载体pMD19T-Vector 连 RPS13 均进行两步法 PCR 扩增，PCR 反应体系与温度均一致，PCR 产的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图 2 所示，三个 RPS13 均在分子量为 5出现明亮条带，表明得到了预期大小的 RPS13 目的条带。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.53

【参考文献】