农杆菌介导LovD基因转化红曲霉高产洛伐他汀研究

发布时间：2020-03-27 10:05

【摘要】：洛伐他汀是当今世界治疗高血脂症控制胆固醇最有效果的药物之一,目前洛伐他汀主要采用化学合成。红曲霉有多种对人类有效的次生代谢产物,其中包括洛伐他汀。人们体内的3-羟基-3-甲基-戊二酸单酞CoA还原酶对于调控胆固醇的合成起着关键性作用,洛伐他汀的生理功能是对此酶的活性有抑制作用,从而达到胆固醇量的减少,其中酰基转移酶LovD在洛伐他汀的生物合成途径中非常重要,本文将通过对LovD基因的研究转化达到洛伐他汀产量的提高。本实验以通过紫外诱变筛选红曲霉菌株M120-1为基础材料,经由根癌农杆菌介导对LovD基因进行转化的研究。提取红曲霉菌株总RNA,通过RT-PCR反转录技术克隆出LovD基因对其构建载体,连接后转化到大肠杆菌中,采用单因素实验优化转化条件,得到的转化子通过高效液相色谱法(HPLC)分析筛选高产洛伐他汀菌株。利用根癌农杆菌介导法构建优质且高效的红曲霉遗传转化系统,期待为红曲霉洛伐他汀的基因功能方面的探究奠定基础。研究结果:(1)提取红曲霉菌株M120-1总RNA,合成cDNA序列,经纯化回收后,成功与表达载体连接,最终顺利转化到大肠杆菌中。(2)优化后得到的最佳遗传转化体系为:将原生质体稀释为1×105个/mL;把红曲霉接于PDA培养基中,30 ℃培养13天;根癌农杆菌的浓度培育至OD600值为0.6;乙酰丁香酮(AS)溶液稀释为140μmol/L。(3)利用优化后的体系对红曲霉菌株进行转化,共得到了 1000左右的转化子,随机挑选了 12株进行PCR鉴定有10株LovD基因顺利导进到红曲霉基因组中。(4)将成功转化的菌株培养后通过HPLC对洛伐他汀分析,其中MD-5洛伐他汀产量高达0.55 mg/mLL比原始菌株高出63%,经传代培养9代分析表明具有良好的遗传稳定性。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q933

【相似文献】