水稻类病变早衰基因LMES3和LMES4的克隆与功能研究

发布时间：2020-03-28 00:15

【摘要】：叶片衰老是一个复杂的生物学过程,通常发生在植物发育的最后阶段,由环境信号和多基因网络参与调控。类病变突变体能自发形成类似于过敏反应的坏死斑,且大多数突变体能表现出对一种或多种病原菌的抗性,是一类研究植物防御反应机制的理想材料。尽管目前对植物叶片衰老和防御反应的分子机理有了一定的研究,但其分子调控网络仍有待进一步丰富和解读,从而为开展水稻分子设计育种,培育抗衰老高产新品种打下基础。本研究通过EMS诱变粳稻品种云稻32(Y32)种子获得两个稳定遗传的类病变早衰突变体,分别命名为:lmes3(lesion mimic and early senescence 3)和 lmes4(lesion mimic and early senescence 4)。经表型鉴定、基因定位与克隆、抗性鉴定及功能分析等相关研究,主要结果如下:1、lmes3突变体苗期地上部表现正常,但根系发育受阻;分蘖早期叶片就出现铁锈斑表型,随着植株的生长,斑点数目增加;进入孕穗期,叶尖开始枯黄,出现早衰表型;抽穗期枯黄从叶尖开始沿着叶边一直延续到叶的底部;成熟期斑点连片存在,衰老加速,叶片全部枯黄,整个植株呈黄褐色直至提前枯死。在苗期和分蘖期对植株进行低温处理时,能诱导lmes3突变体表现出早衰现象。lmes4突变体苗期地上部也表现正常,在分蘖早期叶片出现类似于过敏反应(hypersensitive response,HR)的类病斑,同时整片叶片叶脉间的叶肉部分出现失绿黄化症状,而叶脉仍然保持绿色;到抽穗期时,突变体下部叶片叶尖枯黄加剧,上部功能叶片叶尖开始枯黄并伴有水渍状斑点,整片叶片叶脉间的失绿黄化症加重;成熟期叶尖完全枯黄,叶脉间黄化症连片出现,并从叶尖一直延续到叶中部,直到整片叶片三分之一以上完全枯死;成熟后20d,突变体叶尖完全枯死,但整片叶片还有部分保持绿色,叶片表现为过早衰老。与野生型相比,lmes3突变体的抽穗期晚3d,lmes4突变体的抽穗期晚2d,lmes3和lmes4突变体的株高、结实率及千粒重均显著性降低,而穗长、有效穗数、每穗粒数差异不明显。2、遗传分析表明,lmes3和lmes4突变表型均受单隐性核基因控制。利用图位克隆法,最终将LMES3基因定位在第5染色体P27和P33之间约55kb的物理区间内;将LMES4基因定位在第1染色体M25和M48之间约48kb的物理区间内。通过RGAP(Rice Genome Annotation Project)网站上的注释查询,发现LMES3基因定位的区间包含8个开放阅读框(open reading frame,ORF),测序发现第2开放阅读框上发生一个G到A的单碱基突变,造成了编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)替换成了赖氨酸(Lys),经转基因互补和过表达实验证实其就是LMES3的候选基因。LMES4基因定位的区间包含7个开放阅读框,测序发现第6开放阅读框上发生一个G到A的单碱基突变,造成编码氨基酸由色氨酸(Try)替换成了终止子,导致翻译提前终止,最终造成蛋白质功能缺失。3、LMES3和LMES4为两个未报道控制叶片早衰的新基因。组织特异表达分析表明LMES3基因在各个组织器官均有表达,其中在茎中表达量最高。亚细胞定位分析表明,LEMS3蛋白最终定位于细胞膜上。4、叶绿素含量的下降是叶片衰老的重要生理指标。相关测定结果显示,lmes3和lmes4突变体叶片中叶绿素的含量较野生型均显著下降,这表明两个突变体在生理水平上均已经开始早衰。衰老诱导的SGR(STAY GREEN)基因在调节叶绿素降解代谢的过程中发挥着重要的作用,而 qRT-PCR(quantitative real-time,PCR)也证明 SCG 在lmes3和lmes4突变体的叶片中的表达量均显著上调。此外,lmes3和lmes4突变体的离体叶片在黑暗诱导下均比野生型衰老更为迅速和剧烈,这表明LMES3和LMES4基因的突变加快了叶片衰老。5、叶肉细胞的超微结构显示,lmes3和lmes4突变体的叶绿体中类囊体排列比较紊乱,片层排列不规则,嗜锇颗粒的数量增多,体积增大,颜色加深,且lmes4中叶绿体数目有所减少。这些结果表明LMES3和LMES4基因突变影响了叶绿体的发育,从而导致叶绿素含量显著下降,叶片提前衰老。扫描电镜观察发现lmes4叶片单位叶面积内气孔和周边排列的硅质化爪状突起的数目减少,表明其水分蒸腾作用下降,推测一些随水份吸收和流动的矿质盐类(无机盐)运输减弱,进而导致叶片正常生理活动受阻,造成叶片早衰。6、组织化学染色表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)——超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)在lmes3和lmes4突变体叶片中积累,叶片丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加,这些结论充分表明lmes3和lmes4突变体叶片已经发生早衰。为了探索lmes3和lmes4突变体中ROS的代谢过程,检测了野生型和突变体中抗氧化酶过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的酶学活性,其中POD和SOD活性在lmes3和lmes4突变体的叶片中显著升高,而CAT活性则显著降低。POD和SOD活性的升高表明lmes3和lmes4突变体可能在积极地响应H2O2和O2-的积累,而lmes3和lmes4突变体叶片中CAT活性的降低可能不足以清除这些额外的H2O2,致使H2O2大量积累。积累的ROS在lmes3和lmes4突变体的叶片早衰和防御反应过程中发挥着重要的作用。7、qRT-PCR分析表明,在lmes3和lmes4突变体叶片中,衰老相关的标志基因Osl2和Osl85,相关的转录因子OsWRKY23和OsNAC2表达均上调,光合系统相关基因rbcS、lhcA、lhcB表达均下调。这些结果在分子水平上证实了 lmes3和lmes4突变体的叶片发生了早衰。8、接种白叶枯病菌浙173(Z173)后,野生型Y32植株表现出典型的白叶枯病发病症状,而突变体植株却显著提高了对白叶枯病的抗性。qRT-PCR分析发现防御反应相关基因PR1a、PBZ1和OsWRKY45的表达量在lmes3和lmes4突变体叶片中均显著上调。这些结果表明,LMES3和LMES4基因突变可激活植株防御反应,进而增强抗白叶枯病的能力。上述结果表明LMES3和LMES4基因突变可导致叶片早衰和防御反应的产生,ROS(02-和H2O2)可能参与了这两个生物学过程。其中,水稻LMES3的编码蛋白是一个多功能蛋白,在叶片早衰、防御反应及非生物胁迫途径中扮演着重要作用,其生化作用机制仍有待进一步研究。
【图文】：

植物内源激素,叶片衰老,模式图,营养缺乏

而外因则主要包括极端低温、黑暗、干旱、营养缺乏、机械损伤、臭氧和病原菌侵染逡逑等各种胁迫的刺激［３，４５４吹因此，叶片衰老的过程并不是受某个单一因素调控的，而是存逡逑在一个非常复杂的调控网络［３］（图１．２）。逡逑

结构域,激酶,基序,释放信号

ｐｒｏｔｅｉｎｓ，邋ＣｍＤ４）结构域［２１５］。该结构域的主要组成在植物中高度保守，包括典型的核苷酸逡逑结合激酶ｌａ邋（Ｐ－ｌｏｏｐ），激酶２邋（ＷａｌｋｅｒＢ）和激酶３ａ邋（ＲＮＢＳ－Ｂ）和一些功能未知的保守逡逑基序如ＲＮＢＳ－Ａ，ＲＮＢＳ－Ｃ，ＧＬＰＬ，邋ＲＮＢＳ－Ｄ，ＭＨＤ［２１４】（图１．３）。尽管这些基序的具体逡逑生化功能不是很明确，但是结构域替换实验证明它们在行使ＮＢ－ＬＲＲ蛋白功能中都是不逡逑可或缺的［２１５］。逡逑１．３．３羧基端ＬＲＲ结构域及其功能逡逑ＮＢ＾ＬＲＲ邋蛋白邋Ｃ邋端的邋ＬＲＲ邋结＿或一Ｍ丨堤由邋ＬｘｘＬｘｘＬｘｘＬｘＬｘｘ（Ｎ／Ｃ／Ｔ）ｘ（Ｘ）ＬｘｘＩＰｘｘ邋（ｘ邋表示任逡逑意氨基酸残基）重复组成它是因亮氨酸在结构中呈规律的重复而命名的。但每个ＬＲＲ逡逑的一级结构和重复数上有很大的变化。研究表明，ＬＲＲ结构域能识别病原物无毒基因产逡逑物，弓Ｉ发抗性反应的产生是抗病专化性的基础［２１８］。例如，在Ｐ／ｔｏ／ｄｖｒ－Ｐ／ｔｏ的直接互逡逑作中，，Ｐ／ｔｏ表达产物与ｄｖｒ－Ｐ／ｔｏ表达产物的特异性结合与ＬＲＲ区域有关１２１９］。逡逑与下游信号分逦｜参与对上游ＡＶＲ逡逑子互作的平台逦￥逦蛋白特异性识别逡逑\l＼弩逡逑ｙ邋＜ｓ＞邋0邋＼邋0逡逑通过ＡＴＰ水解酶活性调逡逑控分子构象以释放信号逡逑图１．３ＮＢ－ＬＲＲ蛋白分子结构图［２２（）］逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ．３邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＮＢ－ＬＲＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.11

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