scFv17对AD转基因小鼠异常步态及小脑相关病理变化改善作用的研究

发布时间：2020-03-28 04:13

【摘要】：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是普遍存在于老年人中的神经退行性疾病,其典型症状是进行性的认知和记忆功能损害,同时伴有不同程度的步态紊乱。Aβ(amyloidβ)一直被认为是AD免疫治疗的重要靶点。目前关于Aβ免疫治疗的研究很多,但多集中在药物对抗认知功能损害或情绪变化等方面,而关于药物对AD异常步态的相关作用却还未见报道。单链可变抗体片段(single chain variable domain antibody fragment 17,scFv17)是针对Aβ_(31-35)5个氨基酸序列作用的单链可变片段,能够明显清除脑内Aβ沉积,改善认知功能。本研究将利用PS1M146V/APPswe/tauP301L(3xTg-AD)三转基因小鼠,采用步态行为学实验方法,观察慢性鼻饲给予scFv17对3xTg-AD小鼠步态行为的影响。并在此基础上,我们采用多种形态学方法,观察给予scFv17后小脑相关脑区的病理学变化,以进一步阐明scFv17改善小鼠步态行为的可能的病理学机制,为AD治疗提供新的实验策略及依据。方法:本实验首先选用6月龄3xTg-AD小鼠和C57BL/6野生型小鼠,观察记录它们的步态行为,在12月龄时发现3xTg-AD小鼠的步态严重受损后,将上述两种小鼠随机分为野生型对照组(WT+PBS)、野生型给药组(WT+scFv17)、3xTg-AD对照组(3xTg-AD+PBS)以及3xTg-AD小鼠给药组(3xTg-AD+scFv17)四组。采用鼻饲方法,每次给予每只小鼠20μl的scFv17(1.5mg/kg)或者等体积的PBS(0.01M),每周两次,连续给药12周后进行步态行为测试及小脑病理学检测。1.步态分析让小鼠自由、无停顿、无干扰地通过步态分析仪的跑道,同时利用高速摄像机记录30cm长度范围内小鼠足部信息,经特定分析软件分析后获得步态参数,包括站立时间百分比(Stance Time Percent)、摇摆时间百分比(Swing Time Percent)、后爪步幅宽度(Rear Track Width),以判断各组小鼠的运动平衡和协调能力。2.病理学检测小鼠经心脏灌注、取脑后,矢状面朝下石蜡包埋保存,之后经切片、摊片、烤片后,进行以下实验:(1)HE染色实验观察小脑蚓部的形态结构变化。(2)尼氏染色实验观察小脑蚓部浦肯野细胞的胞浆尼氏体损伤以及scFv17对其的改善作用。(3)石蜡免疫组化实验经过烘烤的小脑切片在经过脱蜡,蒸馏水洗后,按照热抗原修复→灭活内源性过氧化物酶→血清封闭→一抗孵育→二抗孵育→辣根酶标记链霉素卵白素三抗处理→显色→终止显色→苏木素复染→脱水→透明→封片的步骤完成实验,后经Scanscope数字病理切片扫描成像系统扫描、截图后,观察分析比较各组小鼠小脑蚓部皮层Aβ斑块(6E10)的分布,浦肯野细胞(Purkinje cells,PCs)内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)(AT8)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)及其高亲和力受体TrkB,以及分子层突触素(synaptophysin)的表达情况,探究scFv17对小脑相关病理变化的改善作用。结果:1.步态实验中,我们发现,(1)与同月龄WT组小鼠(P㩳0.001),6月和9月龄3xTg-AD小鼠(P㩳0.001)相比,12月龄3xTg-AD小鼠后爪步幅宽度明显增宽;12月龄3xTg-AD小鼠相比同月龄WT组小鼠(P㩳0.001)、6月和9月龄的3xTg-AD小鼠(P㩳0.001)站立时间百分比更大,摇摆时间百分比更小。(2)与野生型对照组小鼠相比较,3xTg-AD对照组小鼠的后爪步幅宽度明显增宽(P㩳0.001);野生型给药组小鼠的后爪步幅宽度与野生型对照组相比无统计学差异(P㧐0.05),但3xTg-AD给药组的后爪步幅宽度明显小于3xTg-AD对照组(P㩳0.05)。(3)3xTg-AD对照组小鼠相比野生型对照组,站立时间百分比明显增大(P㩳0.001),而摇摆时间百分比明显减小(P㩳0.001);野生型给药组的两个时间百分比参数与野生型对照组相比无统计学差异(P㧐0.05),但经scFv17治疗后3xTg-AD给药组小鼠站立时间百分比明显小于3xTg-AD对照组(P㩳0.01),其摇摆时间百分比明显大于3xTg-AD对照组(P㩳0.001)。2.HE染色实验中,野生型给药组和野生型对照组小鼠的小脑浦肯野细胞排列整齐密集,细胞结构清晰,胞浆红染胞核蓝染,胞核圆形或椭圆形,核仁清晰,形态正常;3xTg-AD对照组小鼠的小脑浦肯野细胞排列比较稀疏,轮廓模糊,凋亡细胞多,经scFv17治疗后的3xTg-AD治疗组小鼠细胞凋亡程度轻,形态较3xTg-AD+PBS组小鼠有所改善。3.尼氏染色实验中,3xTg-AD对照组与野生型对照组相比,尼氏染色阳性浦肯野细胞密度明显降低(P㩳0.001);野生型治疗组与野生型对照组相比,细胞密度没有显著性差异(P㧐0.05),但scFv17明显上调了3xTg-AD治疗组浦肯野细胞的数目(P㩳0.001)。4.石蜡免疫组化中,(1)与野生型对照组相比,3xTg-AD对照组Aβ斑块数量明显增多(P㩳0.001),而慢性鼻饲scFv17后,3xTg-AD治疗组小脑皮层内Aβ斑块沉积相比3xTg-AD对照组明显减少(P㩳0.001);(2)相对于野生型对照组,3xTg-AD对照组小脑蚓部PCs内存在大量的NFT(P㩳0.001),而单链抗体治疗组3xTg-AD+scFv17组PCs内NFT相比3xTg-AD对照组大幅度减少(P㩳0.01);(3)3xTg-AD对照组与野生型对照组相比,PCs层的BNDF表达量明显降低(P㩳0.001),3xTg-AD给药组PCs层的BNDF表达量相比3xTg-AD对照组明显增多(P㩳0.001);(4)野生型对照组和野生型给药组之间PCs层的Trk-B表达量无统计学差异(P㧐0.05),但是与野生型对照组相比,3xTg-AD对照组其表达量明显减少(P㩳0.001),3xTg-AD给药组Trk-B表达量相比3xTg-AD对照组增多(P㩳0.001);(5)3xTg-AD对照组小脑蚓部分子层突触素阳性颗粒的相对光密度值明显低于野生型对照组(P㩳0.001),而3xTg-AD给药组的明显升高(P㩳0.001)。结论:1.12月龄3xTg-AD小鼠运动协调和平衡能力严重受损。scFv17改善了12月龄3xTg-AD小鼠运动协调和平衡能力。2.scFv17改善了3xTg-AD小鼠小脑蚓部浦肯野细胞的形态结构,减轻了浦肯野细胞的损伤。3.scFv17减少了3xTg-AD小鼠小脑蚓部皮层内Aβ斑块,浦肯野细胞层内神经原纤维缠结(NFT)。4.scFv17增加了3xTg-AD小鼠小脑蚓部浦肯野细胞层内BDNF及Trk-B受体的表达量,同时增加了分子层内synaptophysin的蛋白表达量。总之,scFv17明显改善了3xTg-AD小鼠的步态行为,其机制可能是scFv17清除了小脑蚓部皮层内Aβ斑块和NFT,继而减轻了小脑PCs的病理损伤,提示scFv17有望成为治疗AD异常步态及小脑损伤的一种新策略。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16

【参考文献】