苹果腐烂病抗性的QTL定位及候选基因预测

发布时间：2020-03-29 20:47

【摘要】：苹果腐烂病是我国苹果产业发生最为严重的真菌病害之一,该病害危害严重、防治困难,并且绝大多数苹果栽培品种均可感染此病。因此,确定苹果对腐烂病菌的抗病位点、研究抗病候选基因,将为苹果腐烂病的抗病育种奠定基础,对我国苹果产业具有重要意义。利用苹果腐烂病菌株03-8分别在休眠期、萌芽前、新梢迅速生长期、新梢缓慢生长期和落叶前接种5份苹果种质资源,发现种质资源在休眠期最为抗病,在新梢迅速生长期表现出最大的抗性差异。2012～2015年休眠期(2～3月)和2016年新梢生长期(6～7月)利用苹果腐烂病菌株 03-8 和 xc56 接种'红玉(Malus cdomestica)' × '金冠(M.domestica)' 杂交后代 1486 株;2010～2011年休眠期(3月)利用菌株03-8和xc56接种'紫塞明珠(M asiatica)' × '富士(M.domestica),杂交后代1667株。两个杂交群体的病斑长度均呈连续分布,表明其对腐烂病菌的抗性为加性多基因控制。利用2012～2016年'红玉' × '金冠'杂交群体接种的病斑长度,以及本实验室已构建的高密度SNP遗传连锁图谱,定位得到32个休眠期抗性QTLs和7个新梢生长期抗性QTLs。不同时期的抗性QTLs之间没有重叠或相邻,表明同一杂交群体在不同时期对腐烂病菌的抗性位点不同。利用2010～2011年'紫塞明珠' × '富士'杂交后代接种的病斑长度,以及本实验室已构建的种间遗传连锁图谱,定位得到2个腐烂病抗性QTLs。两个杂交群体的抗性QTLs对应的染色体区域不重叠或相邻,表明不同杂交群体对腐烂病菌的抗性位点不同。两个杂交群体41个抗性QTLs的贡献率在4.4～13.3%之间,表明苹果对腐烂病菌的抗性由多个微效基因决定。根据上述41个抗性QTLs,得到3个在年份间稳定并且菌株间一致的位点,以此为基础进行苹果腐烂病抗性的候选基因预测。它们是G13-1、G13-2和J15-1,共包含568个基因。利用'红玉'和'金冠'的重测序数据,筛选出149个含有双亲间非同义SNP或indel的基因。根据基因功能注释筛选出19个与苹果腐烂病抗性密切相关的基因。在双亲中克隆测序,证实9个基因中的18个非同义SNPs客观存在。在杂交后代中扩增测序,保留在随机群体中符合1:1分离,并且在极端抗、感群体中出现偏分离的5个SNPs^其中,SNP7和SNP11分别位于候选基因MDP0000156108和MDP0000629440的编码区且能导致非同义编码,将其选为腐烂病抗性候选基因。SNP1和SNP2/3位于候选基因MDP0000748479和MDP0000127348上游且能改变预测元件,对其进行基因表达量分析。MDP0000127348在抗病杂合株和感病纯合株之间并无表达模式的差异,因此排除该基因。至此得到3个苹果腐烂病抗性候选基因,分别为剪切因子MdCC1(MDP0000748479)、丝氨酸/苏氨酸激酶受体蛋白MddRLK(MDP0000156108)和转录因子MdoMYB194(MDP0000629440)。总的来说,本研究通过正向遗传学研究方法,在全基因组范围内定位得到3个年份间稳定并且菌株间一致的腐烂病抗性位点,并在其中预测得到3个抗病候选基因,对我国苹果腐烂病的抗病育种具有重要指导价值。
【图文】：

腐烂病,苹果树,果园,病斑

苹果腐烂病是一种枝干病害，其主要危害果树的树干和主枝，导致枝干的皮层坏死，根据逡逑其病症可分为溃疡型和枝枯型两种。一般发病盛期病斑多为溃疡型，发病末期病斑以枝枯型为逡逑主（黄丽丽等，２００１）（图１－１）。逡逑＿逡逑图１－１果园中感染腐烂病的苹果树逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ａｐｐｌｅ邋ｔｒｅｅｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｖａｌｓａ邋ｃａｎｋｅｒ邋ｉｎ邋ｏｒｃｈａｒｄ逡逑溃疡型苹果腐烂病的典型症状为：病斑呈红褐色、水渍状、有酒糟味，发病处组织松软、逡逑按压有汁液流出，撕去病斑表皮后露出鲜红褐色的发病组织。发病后期，病斑处失水凹陷，呈逡逑现灰褐色或棕褐色，树皮表面产生大量的黑色小颗粒，为腐烂病菌的分生孢子器。枝枯型苹果逡逑腐烂病多发生在衰弱树和小枝条上，枝条发病后枯死，表现为无湿腐症状及异味。其病斑起初逡逑呈现红褐色、略潮湿肿起，随着病斑的迅速扩展，，发病枝干整圈均被病斑包围，病部快速变干、逡逑枝条逐渐枯死。发病后期，病斑表皮长出腐烂病菌的分生孢子器，呈小黑点状。除了侵染枝千逡逑外，苹果腐烂病菌有时也可以侵染苹果果实。果实上的病斑呈暗红褐色，为圆形或不规则型，逡逑边缘明显

枝条,菌落,接种点,塑料盒

垂直放入此塑料盒，随后运回实验室进行接种实验。具体的接种操作步骤如下：逡逑第一步，将枝条洗净、擦干，用下端直径为５邋ｍｍ的钢制打孔器在枝条中部打孔，深至木质逡逑部，去除表皮，此圆形区域（直径５邋ｍｍ）即为接种点。逡逑第二步，用小镊子将己准备好的菌饼（直径５邋ｍｍ）立即放置在接种点上，菌丝面贴着枝条，逡逑覆盖己灭菌的湿脱脂棉块、缠绕Ｐａｒａｆｉｌｍ进行接种点保湿；随后，将枝条两端进行封蜡以防枝逡逑条失水。逡逑第三步，准备数个大小一致的带盖塑料盒，用７５％酒精消毒，并在底部放置一层玻璃培养逡逑皿，在盒中倒入３００邋ｍｌ己灭菌的去离子水，水深约为６邋ｍｍ，水不没过玻璃皿；将已接种的枝条逡逑放在玻璃皿上，不直接接触无菌水，盖上塑料盖，盖与盒子之间留有缝隙。将装有接种枝条的逡逑塑料盒放置于恒温光照培养箱中，以饱和湿度、２６°Ｃ黑暗培养。逡逑第四步，于接种的第７天，拆除各接种点的保湿装置，观察各接种点的病斑长度，并用电逡逑子游标卡尺进行测量，平均各＾＾的病斑长度即为某单株接种某菌株的表型值。逡逑接种过程所使用的工具和材料均己进行灭菌处理：打孔器、小镊子、脱脂棉、无菌水和玻璃逡逑皿均预先在１２１邋°Ｃ高压灭菌锅中灭菌２０邋ｍｉｍ塑料盒、接种试验台和恒温光照培养箱内部用均逡逑用７５％酒精浸泡或擦拭，晾干后使用。逡逑
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.611.11

【参考文献】