白氏文昌鱼COMMD基因家族的克隆与免疫功能的初步分析

发布时间：2020-03-30 10:32

【摘要】：COMMD蛋白是近年来被发现的一类蛋白家族,在多细胞生物中广泛存在。COMMD蛋白家族包括COMMD1～10十个成员,对COMMD蛋白序列的分析表明,COMMD蛋白包含200个左右氨基酸残基,所有蛋白成员的羧基末端都具有一个由70-85个氨基酸组成的高度保守的COMM结构域,在蛋白之间发生相互作用时发挥界面的作用。COMMD蛋白是一个多效性因子,参与多种细胞生理反应,包括铜代谢、纳转运、核因子κB(NF-κB)的调控以及细胞周期进程的调节。NF-κB在免疫反应中起开关作用,既能被上调有助于机体抵抗外部病原体的入侵,又能被下调防止过度免疫对机体造成损伤。最近研究发现,COMMD蛋白家族成员可能在核内参与防止NF-κB的过度活化,避免对机体造成损伤的调控,进而参与免疫调节。文昌鱼在进化地位上处于从无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡物种,在结构和发育上都可以作为脊椎动物祖先的模型,是研究动物学免疫和进化的重要模式生物。为了进一步研究COMMD家族基因的功能和进化,本论文以文昌鱼COMMD家族基因为研究对象,通过基因克隆、实时定量PCR、生物信息分析等技术手段对该家族成员的功能及进化进行分析,得到以下的研究结果:(1)采用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆得到白氏文昌鱼COMMD家族基因全长序列(AmphiCOMMDs)。对文昌鱼AmphiCOMMDs序列分析显示,AmphiCOMMD家族蛋白大约由200个氨基酸残基组成,羧基端均包含由70-85个氨基酸构成的保守的COMM结构域,而各成员在氨基末端差异较大。对COMMD家族的基因组结构及相位分析显示COMMD3和COAMMD8在脊索动物中是保守的,而COAMMD1,2,4,7,9则只在脊椎动物中保守。此外,COMMD5和COMMD6只在文昌鱼和斑马鱼中保守。总体上来说COMMD家族基因结构及相位的变化是多样的。与尾索动物海鞘相比,文昌鱼COMMD家族的基因结构更接近于脊椎动物。(2)为了探索COMMD家族的起源与进化,采用贝叶斯法对白氏文昌鱼及处于不同进化地位的代表性物种的COMMD蛋白序列构建系统进化树,结果显示文昌鱼COMMD家族的十个成员分别聚集到各自的亚家族。在各亚簇中白氏文昌鱼AmphiCOMMDs基因处于无脊椎动物和脊椎动物之间,与姐妹物种海鞘相比,白氏文昌鱼与脊椎动物的关系极为接近,这与基因结构及相位分析的结果一致,果蝇则位于每个亚家族簇的底部。保守的基序分析显示所有的十个COMMD家族成员均包含保守基序1和2,基序7只存在于COMMD3,4,5,7,10中,基序11则只存在于COMMD4,5,7,10中。其它的基序特异的存在于不同的亚家族中,特异基序的存在可能与蛋白功能的分化等有关。选择压力分析显示,在进化过程中COMMD家族成员受到较强的选择压力,但也存在一些正选择位点,为COMMD家族成员结构和功能的多样化提供了保证,我们的研究结果为更好地理解COMMD家族基因的功能和进化提供了重要线索。(3)为研究白氏文昌鱼AmphiCOMMDs基因的抗菌功能,我们采用实时荧光定量PCR方法检测AmphiCOMMDs基因在不同组织内(鳃、肝盲囊、肠、肌肉、脊索)以及LPS注射后的不同时间点的表达情况。结果表明除AmphiCOMMD3和AmphiCOMMD5之外,AmphiCOMMDs基因在五种组织中的表达趋势相近,AmphiCOMMD3在肝盲囊、肠和脊索三个组织中的表达水平较高,AmphiCOMMD5在肠中的表达水平相对较高。LPS刺激后AmphiCOMMDs基因的表达水平存在不同程度的波动,推测文昌鱼COMMD成员在应对外界刺激时可能参与了 NF-κB通路的调控。
【图文】：

２．３．１采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取白氏文昌鱼的总ＲＮＡ逡逑用Ｔｒｉｚｏｌ法提取白氏文昌鱼的总ＲＮＡ，琼脂糖凝胶电泳后在紫外凝胶成像系统逡逑中检测，结果如图２．１所示：逡逑Ｍ邋１逡逑■Ｉｆ逡逑■逡逑图２．１文昌鱼总ＲＮＡ的提取逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ａｍｐｈｉｏｘｕｓ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１邋？？总邋ＲＮＡ逡逑２７逡逑

激文昌鱼后在不同时间点提取文昌鱼的总ＲＮＡ并反转录为ｃＤＮＡ，以ｙＳ－ａｃｒｉｗ基因逡逑为内参基因进行荧光定量ＰＣＲ反应。基因和ｆ－ａｃＯ基因的实时荧逡逑光表达如图４．１：文昌鱼经ＬＰＳ刺激后，和的表达逡逑水平先下调后恢复正常，而Ｊｍ／Ａ／ＣＯＭＭＤＰ的表达水平先上调后恢复正常，，同时，逡逑和的表达水平先下调后又表现为上调，与之相反，逡逑与知ＣｍＴＭＤ３、柳／／／ＣＯＭＭＤ７和柳／ＨＣＯＭＭＤＳ的表达水平为先上调然后下逡逑调。逡逑４３逡逑
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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1 吕彩云;白氏文昌鱼COMMD基因家族的克隆与免疫功能的初步分析[D];南京师范大学;2018年

本文编号：2607433