尼罗罗非鱼MHC基因多态性及其与无乳链球菌抗性的关联分析

发布时间：2020-03-30 16:53

【摘要】：罗非鱼作为我国重要的淡水养殖及出口品种,但是近几年链球菌病的暴发引起的高死亡率,已经严重影响到罗非鱼养殖产业的健康发展。因此培育抗病品系,可有效控制链球菌病的暴发。本研究以与免疫功能密切相关的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因为研究对象,通过分析MHC基因的多态性及其与链球菌病之间的关系以及不同群体中MHCⅡA基因多态性和遗传特性;以期为尼罗罗非鱼(Oreochromis niloicus)抗病基因筛选及抗病品种的选育奠定基础。取得主要研究结果如下:1.尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因多态性与无乳链球菌抗性的关联分析本研究利用尼罗罗非鱼40尾易感个体和40尾抗病个体进行MHCⅡA基因多态性与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)抗性的关联分析。结果显示,扩增获得的片段长度为647-775 bp。从80尾尼罗罗非鱼个体中共检测到25个等位基因,隶属于22个等位基因主型。尼罗罗非鱼中的MHC ⅡA基因的第二外显子区域具有高度多态性,并且该基因中至少存在两个基因座。在抗原识别区域(PBR)和非抗原识别区域(Non-PBR)区域的非同义突变率和同义突变率的比值为1.294(1)和1.240(1),表明尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因的第二外显子区域在进化过程中受正向选择作用影响。在第一次感染实验中发现等位基因Orni-DAA*0501与无乳链球菌抗性性状显著相关,等位基因Orni-DAA*1/01,Orni-DAA*1301,Orni-DAA*1401和Orni-DA4*1201与无乳链球菌易感性状显著相关。本实验为了证实MHC ⅡA特定等位基因与无乳链球菌抗性的相关性,利用惠州尼罗罗非鱼群体进行第二次感染实验。结果发现,等位基因Orni-DAA*1101在惠州易感群体(HZ-SG)中的频率显著高于惠州抗病群体(HZ-RG)的频率(P0.05)。然而,等位基因 Orni-DA4*0501 在 HZ-SG 和 HZ-RG 中并不存在,并且Orni-DA*1201,Orni-DAA*1301和Orni-DAA*140 等位基因的分布频率在HZ-RG高于HZ-SG。由此表明,等位基因Orni-DAA*1101在尼罗罗非鱼的分子辅助育种计划中,可作为与疾病易感相关的分子标记。2.尼罗罗非鱼MHC ⅡB基因多态性与无乳链球菌抗性的关联分析本研究通过对20个家系1800尾尼罗罗非鱼(F1)进行无乳链球菌的感染实验,每个家系具有不同的存活率。根据每个家系的抗病能力,本实验从20个家系中挑选12个家系(从P0代亲本的每个家系中挑选20尾尼罗罗非鱼)进行研究。结果显示,扩增获得的片段长度为770-797 bp,从240个个体的1423条序列中共发现22个不同的等位基因,9个等位基因主型。其中核苷酸位点变异百分比为63.58%,氨基酸变异百分百为63.58%。β1和β2结构域整体的非同义突变率和同义突变率的比值为1.4595,由此说明尼罗罗非鱼MHCⅡB基因在进化过程中受正向选择作用的影响。根据12个家系(F1)在感染无乳链球菌后的存活率,由此判定,等位基因 Orni-DAB*0107,Orni-DAB*0201 和 Orni-DAB*0302 与无乳链球菌抗性性状显著相关,等位基因Orni-DAB*0701与无乳链球菌易感性状显著相关。然而本实验团队前期发现等位基因Orni-DAB*0201与无乳链球菌抗性性状相关,因此,在尼罗罗非鱼的抗病品种选育过程中,可将等位基因Orni-DAB*0201用作抗病相关分子标记。3.尼罗罗非鱼β2m基因单核苷酸多态性与无乳链球菌抗性的关联分析β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)作为MHCⅠ类分子的重要组成部分,在鱼类的免疫系统中发挥重要作用。本实验采用直接测序法从P0代尼罗罗非鱼的β2m基因序列中筛选到30个SNPs,21个SNPs位于外显子区域(其中1个SNP位于5'UTR,4个SNPs位于3'UTR,16个非同义突变位点,1个同义突变位点),9个SNPs位于内含子区域。利用Snapshot分型法对F1代的102尾易感个体和102尾抗病个体进行基因分型,并通过Popgen32和PIC-CALC软件统计分析尼罗罗非鱼β2m基因序列的SNPs的He、Ho、Ne和PIC等遗传参数,表明易感群体中7个SNPs为中度多态水平(0.25PIC0.5),抗病群体中25个SNPs为中度多态水平(0.25PIC0.5)。采用SPSS 23.0软件分析了 30个SNPs在F1代两个群体中的基因型频率和等位基因频率,分析其与链球菌抗性或易感性状之间的关系。结果表明:24个SNPs的基因型和等位基因频率与无乳链球菌抗性/易感性状密切相关(PO.05)。通过Haploview软件分析发现30个SNPs构成4个单倍块和14种单倍型。其中,4个单倍型与无乳链球菌抗性性状密切相关(P0.05),4个单倍型与易感性状密切相关(P0.05)。标签SNP分析发现,单倍块2的4个SNPs和单倍块3中的13个SNPs彼此之间高度连锁(r20.9),这意味着我们在β2m基因中发现2个htSNPs。本研究筛选到的与链球菌抗性/易感性状相关的SNP位点及单倍型具有辅助尼罗罗非鱼抗链球菌病品种选育的潜力。4.3个不同尼罗罗非鱼群体MHC ⅡA基因多态性和遗传分化本研究从广东省3个不同养殖地区的91尾尼罗罗非鱼的个体中获得了MHCⅡA的第二外显子区域序列共501条,长度为647～742 bp。对该序列进行分析,共发现12个MHCⅡA等位基因。三个群体中核苷酸序列变异比例为34.73%～60.78%,氨基酸变异比例为68.24%～78.82%,其中惠州群体的变异比例最高(60.78%和78.82%)。遗传多样性分析表明:三个群体中惠州群体的遗传多样性参数最高。群体间分化指数(Fst)、中性检测(Tajima检测)、平均基因流、平均K2-P遗传距离和AMOVA分析的各项数据表明MHC ⅡA基因的第二外显子区域在3个不同群体间遗传分化不显著,存在一定的基因交流。本研究发现的MHCⅡA基因的高度多态性及遗传结果,为尼罗罗非鱼抗病品种的选育以及种质资源的保护奠定了重要的基础资料。
【图文】：

逦烟媻太律论文逦逡逑突变比例高达９５．２４％，在非ＰＢＲ区域中氨基酸变异比例为９０．１６％（５５／６１）。从表１邋－２逡逑中可以发现叫结构域中的ＰＢＲ区域的ｗ值大于Ｎｏｎ－ＰＢＲ区域，山结构域整体00值大逡逑于１，表明尼罗罗非鱼ＭｆｆＣ邋／Ｚ４基囡的0４结构域在进化过程中受到正向选择逡逑（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）影响邋0逡逑ｗ

本实验从４５９条有效序列中共发现２５个等位基因。２５个等位基囡的分布频率逡逑差别较大，其中等位塞因＜９ｒｗ＋－ｍ４＊０７０７在两个群体中的分布频率最高（５２．８４％，逡逑５２．０７％）（图１－３）。另外一些等位基ｇ仅出现１－２次，例如等位基ｇ邋（９Ｗ７＋－Ｄ崩＊０９０３、逡逑Ｏｒｎｉ－ＤＡＡ＊０２０』、Ｏｒｎｉ－ＤＡＡ＊２２０』、Ｏｍｉ－ＤＡＡ＊ｊ0０】和邋Ｏｒｎｉ－ＤＡＡ＊２３（Ｈ邋共邋５邋个等逡逑位基因出现在易感群体，等位、逡逑１５逡逑
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943

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本文编号：2607797