桦褐孔菌非核糖体肽聚酮基因簇的异源表达研究

发布时间：2020-03-31 10:35

【摘要】：桦褐孔菌Inonotus obliquus或Fuscoporia obliqua是一种非常珍贵的多孔菌科褐卧孔菌属药用真菌,其主要寄生在白桦树等树皮或者树干下,子实体呈现不规则的黑色瘤状。其主要分布在北半球高纬度寒冷地区,如波兰、芬兰、俄罗斯,以及中国的黑龙江,吉林等地。桦褐孔菌具有多种药理活性,如抗癌、抗衰老、增强免疫力等。黑色素的生物合成是真菌抵御环境胁迫的重要生存策略,真菌通过DHN和DOPA途径合成黑色素,但桦褐孔菌水溶性黑色素的合成不受这两个途径的专化性抑制剂熊果苷或三环唑抑制。前期研究发现桦褐孔菌一杂合的非核糖体肽合成酶-聚酮合成酶基因(nrps-pks)表达产物与其水溶性黑色素相似,且该基因与蛋白激酶、二肽酶及溶血素共调蛋白等10个基因形成NPM(非核糖体肽聚酮)基因簇。为了研究桦褐孔菌NPM基因簇的相关功能,本文将在实验室前期研究的基础上展开以下研究:1.以构巢曲霉分子遗传操作体系为基础,以同源重组和融合PCR技术为手段,构建构巢曲霉NPM基因簇表达菌株。2.以酿酒酵母异源表达体系为基础,以质粒重组技术为手段,构建酿酒酵母nrps-pks分段表达菌株。3.以乳酸乳球菌NICE蛋白表达体系为基础,以质粒重组技术为手段,构建乳酸乳球菌HCP基因表达菌株。4.以构巢曲霉wA位点转入nrps-pks基因及NPM基因簇的菌株为基础,以四种不同氨基酸做底物,研究其表型变化。实验结果显示:经过长达十次的分段转化成功将桦褐孔菌NPM基因簇完整转入构巢曲霉wA位点;以质粒重组技术构建的nrps-GST-pXW55载体和nrps-pksGST-pXW55载体在酿酒酵母中得到了成功表达;以质粒重组技术构建的HCPpNZ8148在乳酸乳球菌中得到了成功的表达;经过四种氨基酸做底物,培养基中菌株均出现了不同程度的表型变化,尤其是以苯丙氨酸,色氨酸和异亮氨酸做底物时表型变化最为明显。结果显示NRPS-PKS最优先选择异亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸为底物,具有底物特异性。本研究虽以桦褐孔菌NPM基因簇及相关基因异源表达菌株的构建为基础,但这将为后续nrps-pks表达产物结构单元、化学结构以及NPM基因簇中与nrps-pks转录激活、表达产物结饰以及跨膜转运密切相关的基因功能研究提供必须材料,进而为开展桦褐孔菌黑色素合成新途径的研究奠定基础。
【图文】：

图 1-1 DHN（a）和 DOPA（b）黑色素的结构Fig. 1-1 Structure of DHN（a）and DOPA（b） 1-2 DOPA（A）和 DHN（B）黑色素的合成途The way of DOPA（A）and DHN（B）melanin合成的生物学意义菌生物体赖以生存的必需物质，但是其

图 1-2 DOPA（A）和 DHN（B）黑色素的合成途径Fig.1-2 The way of DOPA（A）and DHN（B）melanin synthesis菌黑色素生物合成的生物学意义色素虽然不是真菌生物体赖以生存的必需物质，但是其独特的生理功能的生活史中产生着巨大的作用。比如黑色素可以显著增强真菌生物体在环境中存活能力和竞争能力，是真菌在高温、寒冷、高盐、高辐射、干旱件下的重要保护伞。与此同时，真菌致病性的强弱也是和黑色素的合成有联系[8]。然而近些年以来，真菌黑色素的抗辐射和抗肿瘤作用是整个科学热点。如在长期受到核辐射地区发现了可以大量繁殖的黑色真菌[9]，它们能力很强。此外也有发现表明，，受紫外线辐射较为强烈的地区黑曲霉孢子的含量远高于未受紫外线辐射的黑曲霉[10]。这些发现均说明了真菌黑色
【学位授予单位】：江苏师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.3

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本文编号：2608963