小麦的5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶沉默子转化和HD2基因家族鉴定

发布时间：2020-04-08 03:50

【摘要】：表观遗传修饰(Epigenetic modification)是生物体生长发育过程中调控基因表达的重要手段,甲基化和乙酰化是其中最重要的两种修饰方式,参与生物体的许多调控过程。小麦是世界上重要的粮食作物之一,其基因组庞大而复杂,目前其表观遗传学方面的研究还不多。5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶(DME)是植物体内一种重要的去甲基化双功能酶,参与植物体内许多重要的生物过程。HD2基因家族是植物体内特有的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)亚家族,参与植物体多个器官组织的生长发育过程,同时在植物非生物胁迫响应中具有重要作用。本研究通过构建pUbi-DMEhp沉默质粒,将其转化得到转基因小麦植株,以沉默小DME基因的表达,为进一步研究小麦中DNA甲基化/去甲基化作用奠定一定的基础。通过生物信息学方法鉴定小麦HD2基因家族所有成员,并对其基本生物学特性和调控网络等进行了分析,同时利用qRT-PCR方法对其在小麦不同生长发育时期热胁迫下的表达模式进行了分析;建过表达载体的构建,为进一步研究小麦HD2基因的作用以及利用其改良小麦品质提供重要基础。本研究获得如下结果:1.以pHMW-DMEhp质粒和pGEM-Ubi-GFP-nos为基础,通过一步克隆法构建质粒,构建得到广谱表达的DME基因发夹结构沉默载体(pUbi-DMEhp)。2.将pUbi-DMEhp载体转化进入小麦未成熟胚中,经培养得到转基因小麦T_0代植株,PCR检测得到5株阳性植株。继续种植得到T_1代,PCR检测得到35株阳性植株。3.利用HMMER和BLAST等生物信息学方法,鉴定得到12个小麦HD2基因,并对其等电点、亚细胞定位和蛋白质相对分子质量等信息进行了预测。根据其蛋白质C端是否具有锌指结构将其分为Group 1和Group 2,并结合其染色体位置信息对其命名。4.利用WheatExp网站,分析了小麦HD2基因在不同组织不同时期的表达量,根据结果取log 2值绘制热图。利用NCBI-SRA数据库中的RNA-seq数据,分析得到小麦HD2基因在热胁迫、干旱胁迫以及热胁迫加干旱胁迫下的表达模式。5.设计特异性引物,分别选取出芽3天和7天、分蘖、春化、起身、拔节、挑旗、抽穗、开花、灌浆早期、灌浆晚期和成熟期十二个时期的小麦植株,进行35℃/1h、42℃/1h处理。然后取其叶片进行qRT-PCR实验。结果发现,大多数小麦HD2基因在在挑旗期和抽穗期热胁迫下表达量明显上升,表明小麦HD2基因可能在小麦生长发育的挑旗期和抽穗期对热胁迫响应具有重要作用。
【图文】：

图 2-1 双酶切 pHMW-DMEhp 质粒Fig2-1 Double digestion of plasmid pHMW-DMEhp定向克隆法设计引物，，扩增 Ubi 启动子。Ubi 启动子长度为 19设计引物后，在前后两端分别加上 21 bp（补全酶切位点以及分）总长度约 2018 bp。经 1%琼脂糖凝胶电泳检测（如图 2-2

的 5-甲基胞嘧啶 DNA 糖基化酶沉默子转化和 HD2 基因家族图 2-1 双酶切 pHMW-DMEhp 质粒Fig2-1 Double digestion of plasmid pHMW-DMEhp克隆法设计引物，扩增 Ubi 启动子。Ubi 启动子长引物后，在前后两端分别加上 21 bp（补全酶切位总长度约 2018 bp。经 1%琼脂糖凝胶电泳检测（如
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1

【参考文献】

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1 邹宏达;小—大麦2H染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究[D];吉林大学;2012年

本文编号：2618848