草莓ARF基因家族启动子预测及ARF4启动子的转录活性分析

发布时间：2020-04-08 22:58

【摘要】：ARF4是植物响应生长素的转录因子,在植物生长发育过程中起着重要作用。目前关于ARF基因启动子的研究较少,并且在草莓中的研究还尚属空白。本研究利用生物信息学技术,预测草莓ARF基因家族启动子的顺式作用元件,推测其基因的功能,并克隆草莓ARF4基因启动子序列,将ARF4基因启动子与GUS报告基因构建为融合基因,通过不同处理来分析ARF4基因启动子的转录活性,为全面揭示ARF4基因功能奠定基础。主要结果如下:1.从草莓基因组网站中获得了9条ARF基因启动子序列,明确了其在草莓基因组中的具体位置。生物信息学分析显示,它们不仅包含了核心作用元件,还含有大量的与光响应、胁迫响应、激素响应及生理机制调控等相关的顺式作用元件。ARF基因家族不同成员之间作用元件的数量和种类存在差异,不同成员间除包含自己特有的元件外,还存在一些共有的元件。2.从‘艳丽’草莓中克隆获得ARF4基因启动子序列。利用生物信息学在线软件分析该序列发现,该启动子不仅含有TATA-box、CAAT-box,还存在多种顺式作用元件,如光响应元件sp1、Box 4等,厌氧诱导元件ARE,真菌诱导子响应元件Box-W_1,蛋白代谢调节作用元件O_2-site,赤霉素应答元件P-box等。在草莓栽培品种‘全明星’、‘甜查理’、‘阿尔比’和‘红颜’中都克隆了ARF4基因启动子序列,序列间未发现作用元件存在差异。3.以pRI 201-AN-GUS为基础载体,将ARF4基因启动子连接到该载体上,获得草莓ARF4基因启动子融合载体,命名为proARF4::GUS。利用农杆菌介导的叶盘转化法,以森林草莓‘Ruegen’为材料,获得了5株转proARF4::GUS基因植株。利用农杆菌侵花的转化方法对拟南芥进行遗传转化,获得5株转基因植株。4.将ARF4基因启动子进行分段缺失克隆,分别构建融合载体proARF4A::GUS、proARF4B::GUS,利用农杆菌介导的果实注射法,注射后通过GUS组织染色检测发现,随着启动子序列长度逐渐变短,proARF4B所驱动的GUS基因的表达最弱。5.对转proARF4::GUS基因草莓植株进行了GUS组织染色,发现在叶柄、嫩叶及新茎中GUS表达水平较高,在嫩叶中表达量最高。利用qRT-PCR方法分析了低温、干旱、NaCl、不同激素种类、不同浓度等处理对转基因植株中GUS基因表达的影响,结果表明在低温、干旱及NaCl处理下,GUS基因的表达量影响不大;与IBA等其他激素相比,IAA能明显提高GUS基因的表达量。进一步研究发现在10μmol·L~(-1) IAA处理12h下GUS基因的表达量最高。
【图文】：

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沈阳农业大学硕士学位论文检测后，挑选产生目的条带的单菌落涂抹在带有 Amp ，，37℃培养过夜。刮取二转生长的菌落加到带有 Amp 温振荡过夜，并送于北京华大基因公司进行序列测定。GM-proARF4。基因启动子进行序列分析NAMAN软件将从草莓基因组网站下载的序列与克隆所用生物信息学在线软件 Plant CARE 对克隆的启动子序析。基因启动子载体的构建 Pst Ⅰ 酶和 Xba Ⅰ 酶进行双酶切，将 ARF4 基因启表达载体中的 35S 启动子来启动 GUS 基因的表达，植

电泳图,草莓,DNA电泳,图片

2‘艳丽’草莓 DNA 电泳图1-2：‘艳丽’草莓 DNAhoresis of DNAextracted from DNAextracted from strawberry ‘列信息，我们下载了 AR线软件 Plant CARE 对序。模板，根据（表 8）中设计67 bp 的特异片段（如图
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S668.4

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