小麦HAK家族成员基因的克隆及TaHAK1-B功能初步分析

发布时间：2020-04-15 02:49

【摘要】：钾离子(K~+)是植物细胞内含量最丰富的一价阳离子,在植物的生长和发育过程中具有重要作用。足够的K~+供应能够增强作物对各种生物和非生物胁迫(如干旱、高盐等)的耐受性,而K~+不足植物会表现出叶色发黄、生长受抑制等缺钾症状。前人研究表明植物对K~+的吸收、转运与分配主要通过钾离子转运通道蛋白和钾离子转运体完成,而钾离子转运体被认为是高亲和性钾吸收系统中的主要成员,负责逆电化学梯度对K~+进行主动运输,并使其在体内高度富集。其中HAK/KUP/KT家族是钾离子转运体最庞大的一个家族,在水稻、拟南芥和白杨中已经分别鉴定出27、13和31个HAK家族基因。目前,在小麦中HAK家族基因只有TaHAK1和TaHAK11被克隆,但是对该家族基因功能的研究还很少。本研究利用同源克隆的方法得到小麦HAK家族基因TaHAK1-B、TaHAK5、TaHAK10、TaHAK14-A和TaHAK14-B,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因的表达情况;利用烟草瞬时表达系统对TaHAK1-B基因进行了亚细胞定位分析;借助缺陷型酵母系统异源表达TaHAK1-B,初步鉴定该基因具有转运钾离子和钠离子的功能;并通过在野生型拟南芥中过表达TaHAK1-B,进一步验证该基因在植物中的功能。主要研究结果如下:(1)从普通六倍体小麦品种矮抗58的gDNA中扩增得到TaHAK1-B基因,基因长度3092 bp,cDNA中扩增到TaHAK1-B基因ORF 2307 bp,编码768个氨基酸;TaHAK5基因ORF 2358 bp,编码785个氨基酸;TaHAK10基因ORF 2484 bp,编码827个氨基酸;TaHAK14-A和TaHAK14-B基因ORF均为2562 bp,编码853个氨基酸。进化分析发现TaHAK1-B、TaHAK5属于HAK家族进化簇Ⅰ,TaHAK10属于HAK家族进化簇Ⅱ,TaHAK14-A和TaHAK14-B属于HAK家族进化簇Ⅴ。(2)利用qRT-PCR方法对这些基因在小麦不同组织中的表达情况进行了分析,发现这四个基因在根、茎、幼叶、老叶及籽粒中均有表达。TaHAK1-B在小麦根部表达量最高,其次是茎;TaHAK5在小麦幼叶中表达量最高,其次是茎、老叶;TaHAK10组织表达模式类似于TaHAK5;TaHAK14基因在小麦茎中表达量最高,其次是叶片。(3)在耐低钾品种豫农186(YN186)中,通过qRT-PCR分析四个基因在缺钾条件下根和叶中的表达模式。TaHAK1-B基因的表达在根中明显受钾离子胁迫诱导上调表达;TaHAK5基因经缺钾胁迫在叶片中表达明显上调,缺钾处理12 h表达量最高,约为0 h的11倍,但其在根中则变化不明显;TaHAK10和TaHAK14均受钾离子胁迫在叶片中被诱导上调表达,而其在根中的表达几乎不受影响。(4)利用烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位分析,发现TaHAK1-B定位于细胞膜上,表明TaHAK1-B蛋白可能在细胞膜上发挥功能。(5)在钾敏感突变体酵母菌株CY162中表达TaHAK1-B基因,发现转基因酵母在低钾培养基上比转空载体酵母长势好,表明TaHAK1-B具有转运钾离子的功能。另外,将TaHAK1-B转入盐敏感突变体酵母菌株AXT3K中,在含钠离子培养基上,转基因酵母的长势好于转空载体酵母菌株的长势,表明TaHAK1-B具有转运钠离子的功能。(6)构建TaHAK1-B的超表达载体遗传转化拟南芥,对转基因植株进行表型分析。在含有3 mmol·L~-11 K~+的培养基上转基因株系的根长明显比野生型长,且侧根较野生型多;在100μmol·L~-11 K~+的低钾培养基上野生型几乎不能正常生长,而转基因拟南芥还能生长。这些结果表明TaHAK1-B可能在根的伸长和侧根的发生中具有重要作用。
【图文】：

低钾,信号转导,拟南芥,离子选择性

基因的参与可以减小外界环境对自身的损害。从图1-1 中可以看出，钾离子通道蛋白和钾转运体在参与植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用，但是它们各自的表达部位、表达模式、亚细胞定位、离子选择性和离子通透性又有差异[26]。植物体内调控低钾胁迫的路径复杂而又精确，各个基因功能的发挥都离不开这一调控机制。

模型图,蛋白结构,家族,模型

K/KUP/KT 家族蛋白结构模型 (引用 Véry and Sentenac, KAK/KUP/KTpotassium transporters in plants(quote Véry an
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1

【参考文献】