ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体构建

发布时间：2020-04-15 06:35

【摘要】：目的:构建ECEL1基因的慢病毒载体。方法:1.依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(sh RNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和Eco RI双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用“HIV-1 p24抗原ELISA法”测定样品滴度。2.ECEL1基因RNA干扰慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察显示感染率。并使用real-time PCR法检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后m RNA的表达量。结果:1.照ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。以及通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测样品病毒滴度为3E+8TU/m L。表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。2.ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,于72小时后镜下荧光观察,观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定。使用real-time PCR的方法,实验组人肝癌细胞(BEL-7404)细胞中ECEL1基因在m RNA水平的表达量受到抑制(p0.05),敲减效率达到70.5%。结论:成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品。并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404),为下一步探讨ECEL1基因对肝癌细胞的功能影响奠定了基础。
【图文】：

示意图,阳性克隆,示意图,引物

图 2.1 RNAi 载体构建以及阳性克隆鉴定示意图.2.3.3.2 引物定引物序列（见表 2.3）：表 2.3 鉴定引物表鉴定引物序列（5’→3’）-F CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-R GTAATACGGTTATCCACGCG.2.3.3.3 聚合酶链式反应（PCR）扩增鉴定1）按照（表 2.4）的成分配制聚合酶链式反应(PCR)体系，震荡并混合均匀，入离心机短时间离心。2）在超净工作台上操作，单个菌落为模板，用无菌枪头挑取出，吹打混合匀，放置于 PCR 仪中进行聚合酶链式反应扩增（反应温度和反应时间分别为：4℃ 3min；94℃ 30s； 55℃ 30 s；72℃ 30s，反复循环 22 次；72℃ 5min）。

基因,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶,阳性克隆

ECEL1 基因 PCR 产物琼脂糖凝胶0kb，8kb，，6kb，5kb，4kb，3.5从上至下）组子结果： shRNA 片段的阳性克隆 PCRp（图 3.2）。判断 psc487
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】