转基因水稻种子可培养内生微生物变异分析

发布时间：2020-04-15 10:05

【摘要】：随着转基因作物种植种类和种植面积的增加,转基因作物的安全性问题引起了广泛关注。水稻是全球最重要的粮食作物之一,对转基因水稻的非预期性变异评估是转基因水稻安全性评价的一项重要内容。内生微生物包括定殖在健康植物体内的内生细菌和真菌,转基因水稻种子内生菌菌群分布和结构的变异可能影响其食品和生态安全性。我们以转2mG2-epsps基因水稻为材料,比较分析了日本晴、D349和观28 3个品系转基因和非转基因水稻种子内生细菌菌群的分布差异,并监测了两种储藏条件下日本晴和D349品系转基因和非转基因水稻种子的可培养内生真菌菌群的分布差异和随储藏时间增长的动态变化,还筛选出了一对适用于水稻种子内生细菌PCR的高通量引物,从宏基因组层面对日本晴水稻种子内生细菌的菌群结构进行了分析。主要结果如下:(1)水稻种子内生细菌的检出存在很大的不稳定性,重复检测15次后水稻种子可分离内生细菌的菌群种类才能达到稳定。从所有水稻种子样本中分离出7个类群的内生细菌,代表菌株经鉴定分别Pantoea、Pseudomonas、Leucobacter、Enterobacter、Bacillus、Bactirum、Microbacterium,其中亲本水稻种子优势菌属为B1(Pantoea)和B5(Bacillus)。比较三个水稻品系发现,不同品系水稻种子内生细菌的定殖受2mG2-epsps基因的影响有较大的差异。P1和P3品系水稻种子内生细菌的定殖数量的增加受2mG2-epsps基因插入的影响较大,而P2水稻种子内生细菌的定殖数量受组织培养的影响较大;基因插入增加了 B2(Pseudomonas)在种子水稻种子中的定殖,并使B1(Pantoea)在P3中定殖显著增加,而P2品系水稻种子中B1(Pantoea)的定殖主要受到组织培养效应的影响,使其定殖量显著增加,基因插入和组织培养显著抑制了 B5(Bacillus)在P3品系种子中的定殖量。(2)以3个品系转基水稻种子利用PTN系统追溯GM水稻种子内生细菌定殖量变异的来源,发现P1品系GM水稻种子可培养真菌变异可能主要受到基因插入和转基因过程中的组织培养的影响不同,而P2和P3品系GM水稻种子可培养真菌变异可能主要受到转基因过程中的组织培养的影响,受基因插入影响较小。(3)采用传统分离培养方法跟踪监测了日本晴P1和D349P2两个品系在室温和4℃储藏条件下转基因与其非转基因水稻种子可培养内生真菌的菌群随时间的变化。从水稻种子中共分离出47株内生真菌,归为22个属,47个种,优势类群是Dendryphiella、Curvularia和Fusarium,相对分离频率分别为59.01%、15.51%和8.16%。比较两种储藏条件发现,4℃储藏条件下水稻种子中的带菌率和种类数均高于室温条件,4℃储藏条件更能维持水稻种子中真菌的活性。比较两个水稻品系发现,2mG2-epsps基因插入从总体上增加了水稻种子内生真菌的定殖量和种类数,使其带菌率升高;随着种子储藏时间的增长,转基因和非转基因水稻种子的带菌率和检出种类均呈下降趋势,P1品系转基因和非转基因的相似度逐渐上升,P2品系的相似度逐渐下降,不同品系水稻内生真菌的定殖受2mG2-epsps基因的影响程度有较大差异。(4)7对高通量测序细菌PCR引物的引物序列通过blast同源性比对和与水稻基因组的Primer-blast比对,以及高通量测序验证,发现引物对Pr7(fM1和rC1)更适合作为水稻种子内生细菌的引物用于高通量PCR扩增,能减少水稻细胞器基因的干扰。应用引物Pr7进行的Illumina MiSeq高通量测序的结果分析日本晴种子内生细菌菌群结构,将日本晴水稻种子内生细菌类群归为62个OTU,分为6个门,10个纲,17个目,23个科,37个属,优势菌为泛菌属(Pantoea)、Candidatus Kuenenia属和乳球菌属(Lactococcus),占比分别为3.19%、0.09%和 0.06%。
【图文】：

形态图,水稻种子,内生菌,革兰氏染色

２．４．２水稻种子可培养内生细菌的形态学观察逡逑表面消毒后的ＧＭ水稻及其多重对照样本水稻种子匀浆在ＬＢ平板２８°Ｃ恒逡逑温培养箱中黑暗培养２－５天，每隔２４邋ｈ观察菌落生长情况（如图２－１），从ＬＢ逡逑平板中挑出形态、颜色和革兰氏染色不同的代表单菌落进行划线纯化（图２－２），逡逑并观察菌落形态特征汇总于表２－２，图２－３显示各细菌类群代表菌株的革兰氏染逡逑色结果。可知分离的内生细菌共分为８类，其中Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ８是革兰逡逑氏阳性菌，Ｂ３和Ｂ４、Ｂ７是革兰氏阴性菌，显微镜观察菌的形态，大小都在１？逡逑４＾ｍ之间，都是杆菌。逡逑图２－１水稻种子内生细菌在ＬＢ平板上的分离菌落形态和消毒对照逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋ａｎｄ邋ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｉｎ邋ＬＢ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑图２－２水稻种子内生细菌在ＬＢ平板上的菌落形态逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋ｏｆ邋ｒｉｃｅ邋ｓｅｅｄｓ邋ｉｎ邋ＬＢ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑ｖ逦■■■邋ＨＨＩ逡逑Ａ哪、，＞ｔ逡逑．．＇Ａ；：逦：：逡逑．ａ泌：士？、．－＝逦：逡逑Ｂｉ逦Ｂ２逦Ｂ３逦Ｂ４逡逑－逦Ｂ＇６＾＇逦ｂ－？逡逑图２－３水稻种子内生菌革兰氏染色形态逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｔ

菌落形态,内生真菌,水稻种子,菌落形态

图３－１水稻种子内生真菌在ＰＤＡ平板上的菌落形态逡逑Ｆｉｇ３－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ邋ｆｕｎｇｉ邋ｉｎ邋ＰＤＡ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑图３－２部分内生真菌ＤＮＡＰＣＲ扩增产物电泳图逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｐａｒｔｉａｌ邋ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ邋ｆｕｎｇａｌ邋ＤＮＡ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ逡逑２７逡逑
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q93;S511

【参考文献】