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玉米多聚半乳糖醛酸酶抑制基因ZmPGIP3在抗水稻纹枯病中的功能研究

发布时间:2020-04-18 22:39
【摘要】:植物暴露于不利环境中,会遭受各种形式的胁迫包括非生物胁迫如干旱,盐度和低温,以及由病原体和害虫攻击引起的生物胁迫。这些逆境胁迫会直接影响植物,尤其是农作物的产量和品质,导致减产甚至绝收。为了适应千变万化的环境,植物通过长期的进化,形成了一套复杂的防卫逆境胁迫系统。植物识别各种胁迫信号,并通过加工处理,激活相应的信号转导途径,最终诱导大量植物防卫相关基因的转录表达,从而保护植物免受胁迫的影响。植物多聚半乳糖醛酸抑制蛋白(PGIP)是一种能够特异性识别和结合真菌多聚半乳糖醛酸酶(PG)的结构蛋白,其富含亮氨酸重复(LRR)结构,在植物抗真菌病害中起重要作用。本研究比较实验室前期转录组筛选结果,利用PCR克隆得到了一个玉米PGIP蛋白基因,通过序列比对发现该基因具有LRR结构域,并且存在疏水性N端信号肽结构和保守的半胱氨酸残基对,初步认为是玉米PGIP家族基因。进化树分析表明该基因与其他物种PGIP亲缘关系较近,且与水稻OsPGIP1基因高度同源,确定其为玉米PGIP家族基因,命名为ZmPGIP3。亚细胞定位显示ZmPGIP3基因位于细胞膜或细胞壁中,荧光定量PCR显示ZmPGIP3基因在玉米根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、种子中均有表达,并且在根中表达量最高。胁迫处理后发现ZmPGIP3受到胁迫损伤处理的极显著诱导,同时植物激素茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)能显著诱导ZmPGIP3的表达,推测ZmPGIP3基因可能与抗病相关,并且很有可能通过JA或SA路径参与植物抗病调控。为进一步验证ZmPGIP3的基因功能,构建了 ZmPGIP3表达载体,通过农杆菌介导法将ZmPGIP3转入水稻之中,使其在水稻中过表达,通过PCR进行了阳性鉴定和纯系鉴定,共检测获得了 7个T3代纯系。荧光定量PCR表明ZmPGIP3在7个转基因株系中均有很高的表达量,表明ZmPGIP3已经整合到水稻基因组中,且能够转录。利用随机筛选出的纯系植株,我们对ZmPGIP3的抗病功能进行分析,在接种水稻纹枯病的初步研究中显示,转入ZmPGIP3基因的水稻具有较好的水稻纹枯病抗性。在接种纹枯病菌7天后,野生型对照植株受到了纹枯病害的胁迫,茎干上出现典型的水稻纹枯病菌斑,并且随着感染时间的增加,病斑开始扩散并且数量也增多;但转基因水稻的3个纯系植株在接种的第7天仅仅轻微遭受病菌影响,并没有出现病斑的情况,在第15天才出现明显病斑情况。因此初步认为ZmPGIP3能够增强水稻抗纹枯病能力。为分析转基因水稻的可能抗病机制,测定了转基因植株中胁迫相关基因的表达。荧光定量PCR结果显示,在转ZmPGIP3基因水稻中抗病防御基因PR3、PR8、PR10和OsPAL的表达被诱导,同时转基因水稻中JA合成基因AOC和AOS的表达也被诱导。上述结果表明ZmPGIP3可能通过JA路径来调控水稻抗纹枯病抗性,为今后进一步研究其功能机制做准备,也为分子育种提供了基因资源。
【图文】:

玉米多聚半乳糖醛酸酶抑制基因ZmPGIP3在抗水稻纹枯病中的功能研究


图2.3邋ZmPG/PJ在烟草细胞中的亚细胞定位逡逑其中(a)和(d)分别是sm:邋GFP、ZmPIF3:邋smGFP在荧光下的视野;(b)和(e)分别是sm:邋GFP、逡逑ZmPIF3:邋smGFP在白光下的视野;(c)和(f)分别是sm:邋GFP、ZmPIB:邋smGFP的叠加视野

琼脂平板法,单独处理


PGs能够与平板底物中的多聚半乳糖醛酸发生酶解反应,产生单糖,HCL与酶解区域逡逑结合可见扩散圈,扩散圈圈的大小与PGs活性呈正相关,与ZmPGIP3的抑制作用呈负相逡逑关,因此我们通过琼脂糖平板法测定了邋ZmPGIP3的活性,结果如图2.4所示:每个孔中均逡逑能发现不同大小的扩散圈,加入ZmPGIP3的孔周围的扩散圈明显小于另外两个对照,同逡逑时统计结果也证明ZmPGIP3显著减少了邋PGs的活性,防止了扩散圈的变大,说明ZmPGIP3逡逑抑制了邋PGs的活性。逡逑PGs+ZmPGIP3邋I邋!逦§邋15逦女邋**逡逑c逦逦邋"T ̄"逡逑□逦|10-逦逡逑|逡逑^0-5-逡逑PGs邋[】逦|邋0.0-J?_,_I_I_,_I_I__,__L逡逑ABC逡逑图2.4琼脂平板法测定PGs-ZmPGIP3活性结果逡逑其中A代表PGs+ZmPGlP3处理;B代表PGs+磷酸盐缓冲液处理;C代表PGs单独处理。逡逑Figure邋2.4邋The邋inhibitory邋activity邋of邋ZmPGIP3邋against邋PGs.邋Agarose邋diffusion邋assay邋of邋PGs,邋A:逡逑PGs+ZmPGIP3;邋B:邋PGs+Phosphate邋buffer;邋C:邋PGs逡逑3.4邋ZmPG//^基因表达分析逡逑3.4.1邋ZwPGP基因组织特异性表达分析逡逑提取正常生长的玉米植株的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊和幼嫩籽粒的总RNA,反转录合逡逑成cDNA,,采用RT-PCR的方法对目的基因的表达进行检测,以玉米Actin基因作为内参基逡逑因
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S435.111.42

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本文编号:2632616

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