GmWRI1基因在大豆中的表达及功能初步分析

发布时间：2020-04-19 02:44

【摘要】：大豆作为人们生活中重要的油料作物之一,时时刻刻影响着农业发展。植物油脂越来越被人们重视,提高大豆种子油脂含量也变得越来越重要。本研究以大豆籽粒克隆得到的GmWRI1全长cDNA序列为前提,将已经构建的重组质粒pBASTA-GmWRI1利用Floral Dip法浸染转化缺失wri基因的突变体拟南芥突变体,获得多种转基因拟南芥回补植株,并对野生型拟南芥、超表达拟南芥、拟南芥突变体和回补的拟南芥进行种子油脂含量的分析来验证GmWRI1基因的功能;利用农杆菌注射法侵染转化烟草研究GmWRI1的细胞定位功能;利用CRISPR/cas9系统构建GmWRI1基因的敲除载体,并将CRISPR-GmWRI1和pBASTA-GmWRI1两种载体利用大豆子叶节转化法分别侵染转化大豆,获得超表达大豆和基因敲除大豆。研究结论如下:1.将植物表达载体pBASTA-GmWRI1利用Floral Dip法转化缺失wri基因的拟南芥突变体,获得拟南芥回补植株。并通过索氏抽提法和实时荧光定量PCR分别对野生型拟南芥、超表达拟南芥、拟南芥突变体和回补的拟南芥进行种子油脂含量分析和定量分析。结果显示,超表达拟南芥与野生型拟南芥相比种子油脂含量提高了2.52%,拟南芥突变体与野生型拟南芥相比种子油脂含量下降4.06%,回补的拟南芥与野生型拟南芥种子油脂含量相比下降1.74%。结果初步证实GmWRI1基因对提高种子油脂含量有促进作用,并对基因缺失导致的低油种子的油脂含量有一定的回补作用,通过油脂含量和基因表达量的结果对比发现拟南芥种子中的油脂含量和GmWRI1基因的表达量可能是正相关。2.成功构建了瞬时表达载体pCAMBIA1302-GmWRI1,并将该质粒转入农杆菌EHA105,利用农杆菌注射法注射烟草叶片观察GmWRI1的亚细胞定位功能,结果表明,GmWRI1基因定位于细胞核和细胞膜中。3.利用重组DNA技术构建植物表达载体CRISPR-GmWRI1并转入具有侵染植物作用的农杆菌EHA105中,通过大豆子叶节稳定遗传转化法将超表达载体和基因敲除载体分别转入大豆中,并获得5株T_1代超表达转基因大豆,6株T_0代基因敲除转基因大豆。
【图文】：

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图 2.1 拟南芥种子成熟过程中油脂合成调控的过程[77]Figure 2.1 Regulation of oil synthesis during seed maturation in Arabidopsis thaliana于转录因子 GmWRI1 与下游调控基因所结合的顺式作用元件在其他植物是通过 AW-BOX 来相互作用。实验室前期已经通过酵母单杂体系统进行GmWRI1 作为 AP2/EREBP 转录激活因子可以与 AW-box 顺式作用元件发互作用，从而控制大豆下游基因的表达。据 GenBank 上公布的大豆丙酮酸激酶（GmPK）基因的全长序列，查询 G动子序列，并应用 http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm子序列，寻找大豆转录因子 GmWRI1 的结合位点 AW-BOX 顺式作nG](n)7[CG]）。Floral Dip 法浸染转化拟南芥用 Floral Dip 法浸染转化拟南芥的基本流程：石和土壤按照 7：3 比例混合均匀装在灭土的布袋中，进行 121℃高压蒸已灭菌的土装入培养钵里，润湿土壤。发育正常的已经干燥的突变体拟南芥种子放在 1.5mL 离心管中，加入适

大豆种子,质粒,载体,模板

图 3.1 花后 35 天的大豆种子总 RNAM：DL 2000 Marker；1-7：大豆种子总 RNAre 3.1 Total RNA of soybean seeds 35 days after flow：DL 2000 Marker；1-7：Total RNA from oybean s后 35 天的 cDNA 为模板扩增得到目的基因体 pEASY-T1，然后将质粒 pEASY-T1-GmW）中，，对 T 载体进行酶切验证（图 3.3），
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.1

【参考文献】