粘虫Pax6基因片段的克

发布时间：2020-04-19 05:16

【摘要】：粘虫Mythimna separata隶属于昆虫纲(Insecta)鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),是一种典型的季节性远距离迁飞害虫,主要危害玉米、小麦和水稻三大粮食作物。除西藏和新疆外,我国各地均有粘虫灾害发生。迁飞是导致粘虫大范围爆发的主要原因。经变态发育重建的器官在昆虫迁飞中具有重要作用,如复眼和翅膀,这些器官的发生受多种基因的调控。已有研究表明,Pax6基因通过编码转录因子调控果蝇和蟾蜍的细胞增殖、分化与器官的形成。该基因是否调控粘虫胚后发育中器官的重建是值得深究的。本实验根据候选基因法则,以粘虫为研究对象,探究Pax6基因在其胚后发育中的作用,旨在为研究粘虫变态发育和迁飞行为的分子机制提供基础数据,同时也为农业害虫的生物防治提供了新思路。本研究主要通过RT-PCR技术克隆了粘虫Pax6基因部分片段,建立了该基因在粘虫不同发育时期的表达模式,最后通过RNA干扰技术对Pax6基因进行沉默,验证了Pax6基因在胚后发育中的作用。(1)克隆获得长699bp的Pax6基因片段,编码233个氨基酸残基。同源性分析表明,其与棉铃虫Pax6基因同源性高达88%,其次为斜纹夜蛾85%,小菜蛾83%。(2)以EF-1α为内参基因,结合实时荧光定量PCR技术,分析了粘虫不同发育时期Pax6基因表达量的差异,结果表明,Pax6基因在蛹期第2天和第3天的表达量比羽化前其他时期的表达量高。羽化后第一天,表达量迅速升高,显著高于其他时期。(3)利用RNA干扰技术,验证Pax6基因的功能。将合成的Pax6-dsRNA注射入6龄末期粘虫体内,不同时间取材,测定目的基因mRNA表达量的变化。结果表明,注射后第1、2、3天,处理组(注射Pax6-dsRNA组)的表达量明显低于对照组(注射GFP-dsRNA和注射DEPC水),说明RNA干扰有效地抑制了Pax6基因的表达。对RNA干扰后的粘虫蛹及成虫表型观察,结果发现,33%的幼虫化蛹后头壳不能正常蜕去,待羽化后口器发育畸形,不能伸缩;42%的蛹腹部未能形成坚硬的外壳,羽化后翅膀严重褶皱,并影响飞行能力。因此,推断Pax6基因可能与变态发育中多种器官的重建有关。
【图文】：

路线图,路线,粘虫,基因功能

本研究的技术路线

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图 2-1 pMD-18T 载体的结构图具体步骤为：（1）连接。连接的反应体系为：PMD 18-T Vector 1 μLddH2O 3 μLLigation solution 1 5 μLInsert DNA 1 μL将体系充分混匀后，短暂离心，放于 4℃过夜（16 个小时）。（2）转化。① 接冰，，将感受态细胞冰浴融化（不可放于室温融化）。② 将 10 μL（1）中的连接产物加到 200 μL 的感受态细胞中，轻轻混匀，并在冰
【学位授予单位】：山西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.4

【参考文献】