高血压合并三度房室传导阻滞患者SCN5A基因变异及其生物信息学分析

发布时间：2020-05-07 05:04

【摘要】：研究背景:房室传导阻滞(atrioventricular block,AVB)是指房室交界区脱离生理不应期后,心房冲动传导仍延迟或未能传导至心室,阻滞部位可为房室结,希室束或束支等不同解剖水平。其中III度AVB是心脏传导阻滞中最严重的一种,发生III度AVB时所有心房冲动均不能传导至心室,引起完全的房室活动分离。对高血压患者而言,心脏发生结构重塑及电重塑使其AVB易感性增加。随着分子遗传学和生物信息技术的进展,AVB的遗传因素受到广泛关注和重视。迄今为止,相继有家系研究发现AVB相关致病性基因突变,此外也有全基因组关联研究在SCN5A、SCN10A、CAV1、TBX5、ITGA9、ID2等基因上发现与PR间期相关的基因多态性。研究目的:探讨国人SCN5A基因变异与高血压合并III度AVB的相关性。研究方法:收集分析南昌大学第二附属医院高血压合并III度AVB患者临床资料,并将年龄、性别相匹配的高血压患者作为对照组,抽取病例组和对照组的外周血提取全基因组DNA。使用一代测序法对SCN5A基因的外显子及外显子和内含子的交界区进行测序,序列比对筛查基因变异。之后,再采用Fisher's精确检验比较变异位点等位基因频率在病例组与对照组(高血压对照组、Ex AC数据库东亚人群)中有无差异。与此同时,通过生物信息学方法分析基因变异的影响。针对错义变异,采用Polyphen-2、Provean及Mutationtaster三种工具预测变异致病性,并采用ClusterX2.1软件对位点保守性进行分析。针对同义变异,通过生物信息学工具从转录后调控及翻译速度等方面评估变异的影响:采用RegRNA预测剪接位点、剪接调控原件位点及miRNA结合位点,mFold预测变异前后mRNA二级结构,Codon Usage Database数据库查询密码子使用偏好。研究结果:本研究共纳入病例组24例高血压合并III度AVB患者及对照组83例高血压患者,对上述患者进行SCN5A基因测序及序列比对,发现五个已报道的SCN5A基因的单核苷酸变异:c.87AG(p.A29A,rs6599230),c.1673AG(p.H558R,rs1805124),c.1755CT(p.H585H,rs201024847),c.3578GA(p.R1193Q,rs41261344),c.5457TC(p.D1819D,rs1805126),病例组中上述变异的等位基因频率分别为0.6952、0.0952、0.0048、0.0619和0.5810。上述变异的Fisher's精确检验结果及生物信息学分析结果如下:(1)错义变异分析:Fisher's精确检验结果显示两个错义变异c.1673AG及c.3578GA的等位基因频率在病例组和对照组间无统计学差异。CluxterX2.1序列比对结果显示变异氨基酸位点并非完全保守。致病性预测软件Polyphen-2、Provean和Mutationtaster预测c.1673AG为无害变异;c.3578GA经Polyphen-2、Provean预测为无害变异,而Mutationtaster预测其具有致病性。(2)同义变异分析:Fisher's精确检验结果显示同义变异c.87AG及c.5457TC的等位基因频率在病例组低于对照组,具有统计学差异,而c.1755CT无显著差异。RegRNA预测显示本研究中的三个同义变异(c.87AG、c.1755CT和c.5457TC)均不在剪接位点、剪接调控原件位点及miRNA结合位点上。运用mFOLD软件,进行变异前后的mRNA二级结构预测,结果显示c.87AG变异后mRNA二级结构较变异前存在明显差异,其最小自由能降低,利于mRNA二级结构的稳定;c.1755CT变异后mRNA最小自由能及二级结构空间构象均无明显改变;而c.5457TC变异前后二级结构空间构象虽差别不大,但变异后mRNA最小自由能增加,不利于mRNA二级结构的稳定。采用Codon Usage Database数据,查询并比较变异前后密码子使用的频率,结果显示c.87AG变异后的密码子使用频率低于变异前;c.1755CT及c.5457TC变异后密码子使用频率高于变异前。结论:(1)SCN5A基因变异c.87AG的等位基因频率在病例组显著低于对照组,变异后mRNA的二级结构更稳定,提示其可能为保护性变异。(2)本研究未发现c.1673AG变异与高血压合并III度AVB存在相关性,而c.1755CT,c.3578GA,c.5457TC变异与高血压合并III度AVB的相关性尚无明确支持依据,为今后临床基因筛查结果判别提供一定的理论依据。(3)基因多态性的致病性和保护性具有条件性作用,单一条件下往往不发挥生物学效应。
【图文】：

码基因（ITGA9）及 DNA 结合抑制因 2 编码基因（ID2）[10-13]。1.3.2 SCN5A 基因与 III 度 AVB心脏钠离子通道是由核心α亚基 Nav1.5 和辅助的β亚基的共同构成的离子传导孔道，广泛分布于心肌细胞及心脏传导系统，其表达量在希氏-浦肯野系统中较高，而窦房结及房室结中相对较低。钠通道在动作电位的 0 相（去极化期）大量开放，内向的钠离子电流（INa）形成动作电位的上升支（0 期），参与心肌细胞动作电位的产生和传导。Nav1.5 即由 SCN5A 基因编码，是完成功能的主要结构，该亚基包括四个同源结构域（DI-DIV），每一个结构域又包括 6 个跨膜片段（S1—S6）。国内外已有大量研究发现 SCN5A 基因变异导致钠离子通道功能异常，，可引发多种包括 AVB 在内的多种心脏疾病。图 1-1 为 Nav1.5 结构示意图，已标出既往研究中发现的 AVB 相关突变位点（复合性突变及内含子变异未标出）。

xon28-3-F CTCATCGCCTACGTGATGAGTGxon28-3-R GCTCTAGTGACACTGTCATAG 酶链反应（PCR）以下反应体系（表 2-4）加样至 96 孔板。表 2-4 PCR 反应体系试剂 用量dd H2O 6.0 ul2×Master Mix 8.0ulPrimerF（上游引物） 0.5ulPrimerR（下游引物） 0.5ulDNA 1.0ul已加样的 96 孔板放入 PCR 仪，设定并选择反应程序（图 2。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1;R541

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本文编号：2652481