柠檬UBE2A和UBE2I同源基因的克隆与表达分析

发布时间：2020-05-13 19:44

【摘要】：泛素蛋白酶体途径与配子体自交不亲和密切相关,其通过降解一些特异蛋白参与很多显花植物的自交不亲和过程,而泛素结合酶UBE2在泛素蛋白酶体途径中起着重要的作用。课题组前期从香水柠檬自交不亲和花的转录组数据中筛选到两个泛素结合酶家族UBE2A和UBE2I同源基因片段,为了弄清该基因的特性以及与柠檬自交不亲和的关系,开展了本研究。本研究以香水柠檬(自交不亲和)和白花柠檬(自交亲和)为试材,根据从柠檬花转录组得到的UBE2A和UBE2I同源基因片段,采用同源克隆的方法获得了香水柠檬和白花柠檬2个品种的UBE2A和UBE2I同源基因的ORF和DNA全长,对其序列进行生物信息学分析,对其在两个柠檬不同组织器官以及自花授粉与杂交授粉后不同时间段的表达模式进行分析,并对这两个基因进行了亚细胞定位研究。其主要结果如下:1.通过测序和序列分析发现,香水柠檬UBE2A同源基因的ORF全长是564 bp,DNA全长为1691 bp;白花柠檬UBE2A同源基因的ORF全长为315bp,较香水柠檬短249 bp,DNA全长为887 bp,较香水柠檬短804 bp。香水柠檬和白花柠檬的泛素连接酶UBE2I同源基因的ORF长度均为483bp,两个品种ORF全长仅有一个碱基的差异;其同源基因的DNA序列均为2267 bp。2.利用生物学在线网站及软件对UBE2A和UBE2I同源基因进行生物信息学分析发现,香水柠檬UBE2A同源基因共含有7个外显子,其长度分别为:44 bp,81 bp,115 bp,52 bp,129 bp,105 bp,38 bp。6 个内含子,其长度分别为:166 bp,145 bp,261 bp,366 bp,182 bp,7 bp。香水柠檬UBE2A同源基因的ORF全长为564 bp,编码187个氨基酸,由20种氨基酸组成,其中含量最多的三种氨基酸分别是:Ser21(21,11.2%)、Asp18(18,9.6%)和 Glu16(16,8.6%);其理论分子量为 21200.77784 Da,等电点为4.29。香水柠檬UBE2A泛素连接酶蛋白的三级结构有6个α螺旋,4个β折叠,10个无规卷曲。泛素化位点预测结果显示香水柠檬UBE2A氨基酸序列的第149位氨基酸存在较高泛素化的可能性(score 0.85),第14(score 0.72)和148位(score 0.79)氨基酸存在中等的被泛素化的可能性,第133位(score 0.66)氨基酸存在较低的被泛素化的可能性。整条肽链呈现亲水性,不含信号肽和跨膜结构。在白花柠檬中,UBE2A同源基因含有4个外显子,长度分别为:44bp,81 bp,115 bp,75bp,3个内含子,长度分别为:166bp,145bp,261bp。在香水柠檬DNA的第四个段内含子中的第885-887位碱基为TGA,是白花柠檬UBE2A的终止密码子。白花柠檬UBE2A同源基因的ORF全长为315 bp,编码104个氨基酸,由20种氨基酸组成,含量最多的五种氨基酸分别是:Ser(11,10.6%),Ile(9,8.7%),Val(8,8.7%),Lys(8,8.7%),Pro(8,8.7%)。白花柠檬UBE2A泛素连接酶蛋白的三级结构有3个α螺旋,6个β折叠,7个无规卷曲。理论分子量为11845.73124Da,等电点为5.13。整条肽链呈现疏水性,不含信号肽和跨膜结构。泛素化位点预测结果显示白花柠檬UBE2A同源基因氨基酸序列中不存在泛素化的可能性。柠檬UBE2A同源基因蛋白质的保守结构域均为:UBCc superfamily。香水柠檬和白花柠檬UBE2I同源基因中均含有5段个内含子,长度分别为70bp、81bp、157bp、112bp、63bp。4 个外显子,长度分别为 77bp、1145bp、110bp、452bp。在第2、4个内含子序列中存在两个TATA盒样结构(TATAA)框的结构,也许这种序列与内含子的功能密切相关。香水柠檬和白花柠檬UBE2I同源基因的ORF全长均为483bp,共编码160个氨基酸,氨基酸组成及含量无差异。均由20种氨基酸组成,其中含量最高的三种氨基酸分别是Pro(16,10%),Gly(14,8.75%),Leu(13,8.125%)。其理论分子量为17981.47444Da,等电点为7.64。柠檬UBE2I同源基因蛋白质的保守结构域为:UBCcsuperfamily。柠檬UBE2I泛素连接酶蛋白的三级结构有4个α螺旋,7个β折叠,10个无规卷曲。泛素化位点预测结果显示柠檬UBE2I氨基酸序列的第28位氨基酸(Score为0.70)存在中等被泛素化的可能性,第111位(Score为0.64)氨基酸存在较低的被泛素化的可能性。SUMO修饰位点预测显示UBE2I的第28和54位氨基酸存在SUMO化修饰的可能性。整条肽链呈现亲水性,不含信号肽和跨膜结构。3.利用SYBR实时荧光定量PCR对香水柠檬UBE2A、UBE2I基因在不同组织和香水柠檬自交、杂交授粉后不同时间段的表达情况进行分析。结果显示,UBE2A和UBE2I同源基因在香水柠檬受试的11个组织中均表达,不同组织中的表达情况存在差异。其中UBE2A在花柱和花粉中有较高的表达量,在花柱中表达量最高,在茎、花托、子房中的表达量相对较低。UBE21在花粉、花丝的表达量较高,在花粉中表达量最高,在花托和老茎中的表达量相对较低。UBE2A在香水柠檬自交和杂交后不同时间段柱头中的表达分析显示,在自交授粉0-10h后,表达量略有上升,10h的表达量约为杂交授粉的2.5倍。在自交授粉10-15 h表达量出现下降,在自交授粉后15 h表达量下降至0 h的表达量水平,与杂交时表达量差不多;在自交授粉15h-1d表达量略有上升;在自交授粉后1-2d表达量显著上升,2d的达到最大值,约为杂交后的25倍。UBE2E在柱头中的表达分析显示在自交授粉0 h-10 h后,表达量略有上升,10 h的表达量约为杂交授粉的4.5倍;在自交授粉10-20h表达量出现下降,在自交授粉后20h表达量下降至Oh的表达量水平,约为杂交时表达量的3倍;在自交授粉1d后表达量持续上升,在自交授粉4d时,表达量约为杂交后的5.5倍。综上,结果显示UBE2A和UBE21同源基因可能参与香水柠檬自交不亲和而反应。4.将构建的瞬时表达载体P1300-GFP-UBE2A和P10300-GFP-UBE2I转化到本氏烟草叶片中进行瞬时表达,共培养1-2d后,通过多光子激光共聚焦显微镜,借助绿色荧光蛋白GFP的荧光信号确定目标蛋白在细胞内的分布。结果显示,在转P1300-GFP-UBE2A的烟草叶片细胞中,绿色荧光蛋白主要分布在细胞核中。在转P1300-GFP-UBE2I的烟草叶片细胞中,绿色荧光蛋白主要分布于细胞膜中。5.构建酵母重组质粒 pGADT7-UBE2A,pGADT7-UBE2I 和 pGBKT7-F-box,并对pGBKT7-F-box进行了自激活和毒性检测。证明了重组表达载体pGBKT7-F-box无自激活性和毒性。
【图文】：

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图１－１本实验技术路线图逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｔｈｅ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ逡逑

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【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S666.5

【参考文献】