干旱条件下苹果水分利用效率相关性状的QTL定位和候选基因的筛选与鉴定

发布时间：2020-05-21 21:30

【摘要】：我国的苹果(Malus domestica)栽培面积及产量均居世界首位,苹果产业是支撑我国乡村振兴和农民脱贫的重要产业。然而,水资源短缺严重威胁我国干旱、半干旱地区苹果产业的可持续发展。通过提高水分利用效率(Water Use Efficiency,WUE)实现节水农业,是保证我国旱区苹果产业可持续发展的根本途径。本研究以干旱条件下高WUE品种‘秦冠’和低WUE品种‘蜜脆’为亲本构建的遗传群体为试材,采用RAD-Seq(Restriction-site Associated DNA Sequencing)开发SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)标记,构建苹果遗传连锁图谱,评价不同供水条件下苹果的WUE相关表型,并鉴定干旱条件下与苹果WUE相关的数量性状位点(Quantitative Trait Loci,QTL),筛选有效分子标记及关键调控基因,并对筛选的关键基因进行了克隆及功能鉴定,旨在为干旱下苹果WUE分子机制研究和遗传改良提供基本资料。主要研究结果如下:1.以‘蜜脆’x‘秦冠’F_1株系建立作图群体,利用RAD测序技术开发SNP分子标记,经过标记筛选分群,构建了1张由10172个SNP标记和350个单株组成的双亲遗传连锁图谱。该图谱由17条连锁群(Linkage Group,LG)构成,总覆盖遗传距离2430.52cM,该图谱标记类型和数量分别为:4421个lmxll型标记、1603个hkxhk型标记和4688个nnxnp标记,最长连锁群为LG15,长度为179.97 cM,含有574个标记,最短连锁群为LG9,长度为115.99 cM,含有590个标记;采用其中4421个lmxll型标记和930个hkxhk型标记构建母本‘蜜脆’图谱,含有17条LG,遗传距离1837.61 cM,标记密度0.34cM;采用其中4688个nn×np型标记和935个hk×hk型标记构建父本‘秦冠’图谱,含有17条LG,遗传距离1687.33cM,标记密度0.30 cM。2.对2014、2015两年间,在中度干旱和正常供水条件下苹果群体植株的茎生长量、叶面积、叶片水分状况、叶片光合作用、水分利用效率等共计11项相关表型指标进行评价,并利用构建的遗传图谱进行QTL定位。群体表型评价结果表明,干旱使苹果群体的生长受抑,比叶面积(SLA)减小,净光合速率(Pn)、气孔导度(gs)和蒸腾速率(Tr)下降,叶片保水力(WHC)降低,但干旱提高了苹果的内在水分利用效率(WUEi)和稳定碳同位素组成(δ~(13)C)。另外,WUEi和δ~(13)C在两种供水条件下均表现出较明显的超亲遗传现象。各表型值在群体中均表现出连续的单峰分布,表明这些表型均为多基因控制的数量遗传性状;Shapiro-Wilk检验结果表明,干旱下相对含水量(RWC)、WHC、Pn、δ~(13)C的群体分布类型在年份间存在差异,说明这些性状较其它性状的环境效应更显著。在两年间,干旱条件下群体的WUEi均与Pn呈极显著正相关关系,与gs、Tr呈极显著负相关关系,而干旱下δ~(13)C均与总叶面积(TLA)、Pn呈显著或极显著正相关关系,与比叶面积(SLA)、Tr呈显著负相关关系;群体同一表型在年份间均存在显著或极显著的正相关关系,表明测定指标在年份间的重复性较好。通过QTL定位,2014、2015两年间,在中度干旱和正常供水条件下,我们共获得与11项指标相关的266个QTL,包括22个与苹果内在WUE(WUEi)相关的QTL和33个与长期WUE(δ~(13)C)相关的QTL。其中,检测到2个干旱下年份间共定位,即年份间稳定的WUEi相关QTL:WUEiDS14.LG17.2和WUEiDS15.LG17,以及6个年份间稳定的δ~(13)C相关QTL:δ13CDS14.LG8和δ13CDS15.LG8.1,δ13CDS14.LG15和δ13CDS15.LG15.1,δ13CDS14.LG16和δ13CDS15.LG16.1。检测到22个“QTL热点”区域,这些区域分别包含2~8个QTL。采用KASP分型技术证实了干旱胁迫下与δ~(13)C相关稳定QTL定位的可靠性,并验证了相关SNP标记lm1712(Chr8:12659110),np2623(Chr15:36996403)和np2691(Chr16:4666838)进行基因分型的有效性。3.在干旱下苹果WUE相关稳定QTL对应基因组区域进行基因筛选和表达分析,筛选到36个可能参与干旱下苹果WUE调控的候选基因,它们涉及到光保护、信号转导、物质代谢和转运,或转录调控等生物学过程。其中,18个基因(MAPKKK、PP2A、GL1、ARF、ERF020、ATG4a、LAX、ATGP4、STN7、DnaJ、RLK、ARF17、GOLS1、MPL3、bZIP-1、VPS34、PIP5K1、TAT7等)在WUE差异品种‘秦冠’和‘蜜脆’中对干旱胁迫的表达响应模式或表达水平存在品种间差异,可作为优先候选基因开展深入研究。这些基因的挖掘为干旱下苹果WUE调节机制的研究和WUE的遗传改良奠定了基础。在筛选到的候选基因中,进一步克隆了一个位于δ~(13)C相关的稳定QTL区间,显著受干旱诱导的基因MDP0000217124。通过序列分析和多物种系统进化分析,确认该基因为苹果DnaJ蛋白的编码基因(MdDnaJ)。对该基因启动子的顺式作用元件进行分析表明,其启动子区域包含18个与干旱、热激、低温、缺氧、防御和逆境响应等逆境胁迫响应和多种激素响应相关的顺式作用元件。将MdDnaJ在拟南芥中过表达,对拟南芥转基因株系进行了自然干旱胁迫结合复水和200 mM甘露醇渗透胁迫处理,结果表明,自然干旱20 d后,拟南芥转基因株系叶片丙二醛含量、电解质渗透率水平均低于野生型,而脯氨酸含量显著高于野生型,转基因株系δ~(13)C也显著高于野生型,复水3 d后,3个转基因株系的存活率分别达到64.0%、62.0%和55.3%,均明显高于野生型(17.9%);甘露醇渗透胁迫对拟南芥野生型的生长抑制作用比转基因株系更加显著,逆境下各株系植株鲜重和根长高于野生型。将MdDnaJ在苹果‘王林’愈伤组织中过表达,对转基因愈伤进行150 mM甘露醇渗透胁迫处理,甘露醇渗透胁迫处理后,2个转基因苹果愈伤的鲜重、脯氨酸含量显著高于对照,丙二醛含量、电解质渗透率显著低于对照。本研究结果表明,MdDnaJ基因具有提高植物耐旱、耐渗透胁迫和干旱下WUE的功能。
【图文】：

序列,文库构建,公司,测序

2.1.2.2 RAD 文库构建及测序参考 Chutimanitsakun et al.（2011）和 Wu et al.（2014）方法，利用提取的 gDNA 构建 RAD 文库。首先应用限制性内切酶 EcoRI 对基因组进行酶切，，然后分别对每个样本进行物理打断，构建 200~400bp 插入片段文库。具体流程如图 2-1 所示。（1）酶切：0.1-1μg 基因组 DNA 用限制性内切酶 EcoRI 进行酶切，以得到适合的marker 密度；（2）加 P1 接头：酶切后的片段两端加 P1 Adapter（可与 EcoRI 酶切 DNA 缺口互补）；（3）片断选择：DNA 片段 pooling，随机打断到一定的片段，电泳回收 200bp-400bp的 DNA，末端平化后加 A；（4）加 P2 接头：加 P2Adapter，P2 为局部双链分叉 Y 型 DNA（可实现选择性的扩增同时含有 P1 和 P2 接头的 RAD tag）；（5）高通量测序：PCR 扩增两端分别含有 P1 和 P2 接头的 tag 序列，Cluster 制备，上机测序。参考Illumina步骤，利用 Illumina HiSeq2500测序平台，进行双末端（Paired-End250 测序。测序在北京诺禾致源科技有限公司完成。

遗传图谱,遗传图谱,连锁群,秦冠

4 ‘蜜脆’x‘秦冠’遗传图谱标记所在连锁群与参考基因组染色体对应情况统计4 Statistics of the markers mapping linkage groups ('HC' x 'QG' genetic map) numbered iaccordance with the reference chromosome numbers连锁群 Linkage Groups
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S661.1;S423

【参考文献】