栉孔扇贝几丁质酶基因的克隆及功能鉴定

发布时间：2020-05-26 20:06

【摘要】：为研究栉孔扇贝贝壳形成机理,首先应用质谱分析的方法,研究了几丁质酶在栉孔扇贝贝壳的蛋白质组中所占的比例。进一步利用RACE技术克隆获得栉孔扇贝几丁质酶的c DNA,全长共1587 bp,可编码439个氨基酸残基。氨基酸序列的功能结构域分析表明,该几丁质酶具有保守的几丁质酶特征结构域。组织表达分析表明,栉孔扇贝几丁质酶在外套膜组织中表达量最高,并且在外套膜边缘的表达量高于外套膜中心,推测其参与了贝壳的形成。应用实时定量PCR方法,检测贝壳损伤修复过程中基因表达水平,结果显示,几丁质酶基因表达水平呈现下调趋势,暗示其作为负调控因子参与贝壳修复过程。利用RNAi技术降低外套膜组织中几丁质酶基因的表达水平,同时应用扫描电子显微镜观察贝壳内表面的结构,发现贝壳矿物晶体片层的轮廓呈现不规则沉积。综合以上实验结果,推测几丁质酶通过水解几丁质来保证有机框架的有序性,从而对贝壳形状和外观起到调控作用。研究几丁质酶的基因组织表达规律及其生物学功能,将有助于揭示贝壳生物矿化的机制。
【图文】：

氨基酸序列,栉孔扇贝,外套膜,缺刻

缙诰途龆?了贝壳晶体的结构。参与几丁质生理过程相关的所有酶类中，几丁质合成酶(chitinsynthetase,CS)[24]与几丁质酶的作用最为突出。几丁质合成酶是一种膜结合的糖苷转化酶，在其作用下可以将几丁质前体物合成几丁质，促使几丁质分子的延长；而几丁质酶则催化几丁质的水解过程。二者相反相成的作用在生物体内共同控制几丁质的合成与水解，以保证生物体几丁质相关的生理过程有序进行。几丁质合成酶是一种膜结合蛋白，其氨基酸序列不存在信号肽，属于非分泌蛋白；而几丁质酶是一种分泌蛋白，因此在本研究中的蛋图2栉孔扇贝几丁质酶基因组织分布与缺刻实验实时定量PCR结果(a)栉孔扇贝不同组织中几丁质酶基因表达情况；1.外套膜边缘；2.外套膜中心；3.鳃；4.足；5.生殖腺；6.内脏团；7.闭壳肌；(b)缺刻处理后几丁质酶基因的表达情况Fig.2Real-timequantitativePCRresultsofthechitinasetissueexpressionlevelandshellnotching(a)relativegeneexpressionlevelsofchitinaseindifferenttissuesofC.farreri;1.mantleedge;2.mantlepallial;3.gill;4.foot;5.gonad;6.visceralmass;7.adductormuscle;(b)responseofthechitinasegeneduringshellregenerationaftershellnotching图3RNA干扰实验*.与对照组差异极显著，P<0.01Fig.3RNAiassay*.significantdifferencewithcontrolgroup,P<0.012期王俊，等：栉孔扇贝几丁质酶基因的克隆及功能鉴定193http://www.scxuebao.cn

酶水,实验组,贝壳,扫描电子显微镜观察

因此推测，几丁质酶可能在这一过程中开始表达，被分泌到贝壳上并在框架的修饰过程以及分解多余几丁质的过程中发挥作用。而当贝壳的生长达到一定的成熟程度时，栉孔扇贝体内的几丁质合成酶和几丁质酶的表达就趋于平衡，以维持整个贝壳的正常形态和生长趋势。在软体动物中，外套膜是生物矿化过程的重要部位，许多与矿化过程直接相关的分泌蛋白都在外套膜中大量表达并分泌到体外实行其矿化功能。本研究中几丁质酶的表达具有明显的组织特异性，在外套膜组织中的表达水平显著高于其他组织，也暗示了其在矿化过程中的图4扫描电子显微镜观察贝壳结构(a)空白对照(注射200μL无酶水)；(b)阴性对照(注射40μgofGFP-dsRNA/200μL无酶水)；(c)实验组(注射40μgofcht-dsRNA/200μL无酶水)；(d)实验组(注射80μgofcht-dsRNA/200μL无酶水)Fig.4ThestructuralobservationoftheshellbySEM(a)groupinjectedwith200μLofDNase/RNase-freewater;(b)groupinjectedwith40μgofGFP-dsRNAdilutedin200μLofwater;(c)groupinjectedwith40μgofchitinase-dsRNAdilutedin200μLofwater;(d)groupinjectedwith80μgofchitinase-dsRNAdilutedin200μLofwater194水产学报41卷http://www.scxuebao.cn

【参考文献】