草莓匍匐茎发生基因的定位克隆与鉴定

发布时间：2020-05-27 15:43

【摘要】：匍匐茎是草莓主要的繁殖器官,然而关于调控匍匐茎发生的基因还没有鉴定出来。本研究在无匍匐茎的森林草莓(Fragaria vesca)资源‘Yellow Wonder’(YW)的突变体库中筛选鉴定出一个匍匐茎发生突变体并命名为strawberry runner production(srp),通过调查杂交后代性状对srp性状进行遗传分析,并对srp突变体和无匍匐茎野生型‘Ruegen’(RG)及它们杂交获得的F2代单株组成的混池,进行全基因组重测序以检测突变位点,同时利用传统分子标记进行基因定位,最后通过转基因技术对候选基因进行功能验证。主要结果如下:1.突变体srp可以持续产生匍匐茎,节间伸长,叶片数较野生型YW减少,株高、冠径及叶片大小均显著增加,冠径小幅减少。突变体与野生型RG进行杂交,F1杂种表型与野生型基本一致,F2群体匍匐茎有无个体分离比符合1:3的预期值,说明突变体试材中匍匐茎发生性状是受一个隐性单基因控制的。2.全基因组重测序BSA对突变体进行了定位,一共检测到480106个SNP。计算突变子代有匍匐茎混池的SNP频率,在7条染色体上共鉴定出1583个SNP。在Fvb4上出现了SNP频率的峰值,说明了这条染色体最有可能是调控srp的基因区间。对候选SNP进行分析,在编码赤霉素信号途径中抑制子DELLA的Fve RGA1基因上发现1个SNP,该SNP导致Fve RGA1基因发生了W601*突变(密码子TGG→TGA),从而蛋白质翻译提前终止,因此推测Fve RGA1是调控srp突变体性状的候选基因。3.利用Indel标记,采用传统遗传作图法进行突变位点的确定。在4号染色体(Fvb4)上,根据测序数据的差异开发了Indel标记和设计了CAPS/d CAPS引物。06210-HinfⅠ在突变体srp与RG杂交获得的F2群体中与匍匐茎发生性状共分离,这个标记是根据Fve RGA1这个基因产生的单碱基突变而开发的。因此,这些数据都进一步证明了Fve RGA1是控制srp性状的候选基因。4.基因克隆和测序结果表明突变体srp的Fve RGA1基因第1803个碱基的位置发生了1个鸟嘌呤G到腺嘌呤A的转换(1803G-A),这个结果与重测序中得到的结果完全一致。5.构建了Fve RGA1基因的RNAi载体,分别转化两个不同遗传背景的无匍匐茎的野生型森林草莓YW和RG,所有转基因株系中Fve RGA1基因的转录水平均显著下调且产生匍匐茎,与突变体表型一致,表明Fve RGA1是控制匍匐茎发生的基因。6.从野生型YW中克隆Fve RGA1基因,将其与GUS基因融合从而构建了Fve RGA1基因过表达载体p RI101-Fve RGA1-GUS,转化突变体srp。过量表达Fve RGA1-GUS融合基因的转基因植株节间性状恢复正常,但仍然抽生匍匐茎。我们推测融合GUS基因之后影响了Fve RGA1的部分功能,因此构建了不带GUS基因的Fve RGA1基因过表达载体p RI101-Fve RGA1,进行了4次遗传转化,但是至今没有得到抗性芽。7.亚细胞定位结果表明Fve RGA1定位在细胞核中。实时荧光定量结果表明Fve RGA1在草莓所有的检测器官中均有表达,并且在幼叶,叶柄及茎尖中表达量较高。对Fve RGA1的启动子进行了分析,找到了很多顺式作用元件,包括赤霉素响应元件。8.选取YW和srp的茎尖生长点进行转录组测序,挑选出6个差异基因并进行了表达验证。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S668.4

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