IFN-β基因转染的人脐带源性间充质干细胞对非小细胞肺癌生物学行为的影响

发布时间：2020-05-28 02:02

【摘要】：目的:研究干扰素-β(interferon-β,IFN-β)基因转染的人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)中IFN-β蛋白表达情况,并进一步探讨IFNβ-hucMSCs对非小细胞肺癌细胞株A549和H226克隆形成、迁移和增殖能力的影响。方法:(1)原代huc-MSCs的分离、培养及扩增:利用组织贴壁法从新生儿脐带中分离出脐带组织间充质干细胞,流式细胞技术进行免疫表型分析。(2)根据增强型红色荧光蛋白(Enhanced Red Fluorescent Protein,ERFP)标记的慢病毒-IFNβ基因转染hucMSCs后取上清液作用癌细胞的不同分为以下五组:(1)IFN-β转染组(IFNβ-hucMSCs组)、(2)空载体转染组(NC组)、(3)间充质干细胞组(hucMSCs组)、(4)干扰素组(IFN-β组)、(5)空白对照组(CON组)。(3)ELISA法和Western blot法分别检测IFNβ-hucMSCs组、NC组、hucMSCs组三组细胞上清液中IFN-β蛋白含量和细胞IFN-β蛋白表达。(4)IFNβ-hucMSCs组、NC组、hucMSCs组、IFN-β组、CON组作用A549细胞和H226细胞后,采用吉姆萨染色法检测A549细胞和H226细胞的克隆形成率,Transwell小室检测其迁移能力、CCK-8检测其增殖能力。结果:(1)组织块贴壁法从脐带分离间充质干细胞,生长约2周左右开始有梭形细胞从脐带周围爬出,约3周左右细胞逐渐融合铺满T-25cm~2的培养瓶。细胞传代至第3代可以观察到细胞形成集落、旋涡状生长、形态较一致。HucMSCs表达基质细胞相关表面标记CD73、CD90、CD105;而不表达单核细胞、淋巴细胞、造血干细胞表面标记CD14、CD19、CD34,不表达人类白细胞共同抗原CD45及MHC-II类分子HLA-DR,与间充质干细胞的表型特征相符合。(2)IFNβ-hucMSCs组24小时、48小时、72小时三个时间点上清液中的IFN-β蛋白含量分别为(1228.162±72.940pg/ml)、(1218.693±17.583pg/ml)、(1045.363±41.176pg/ml),NC组24小时、48小时、72小时三个时间点上清液中的IFN-β蛋白含量分别为(45.599±0.792pg/ml)、(47.841±2.553pg/ml)、(47.154±1.078pg/ml),hucMSCs组24小时、48小时、72小时三个时间点上清液中的IFN-β蛋白含量分别为(46.806±2.659pg/ml)、(41.955±3.007pg/ml)、(41.435±2.171pg/ml)。与NC组和hucMSCs比较,IFNβ-hucMSCs组IFN-β蛋白含量明显增高,差异有统计学意义(P0.01),而NC组IFN-β蛋白含量与hucMSCs组比较,差异无统计学意义(P0.05)。IFNβ-hucMSCs组、NC组、hucMSCs组细胞中IFN-β蛋白表达量分别为(0.684±0.136)、(0.112±0.027)、(0.105±0.042)。与NC组和hucMSCs组比较,IFNβ-hucMSCs组的IFN-β蛋白表达量明显增高,差异有统计学意义(P0.01),而NC组IFN-β蛋白表达量与hucMSCs组比较,差异无统计学意义(P0.05)。(3)A549细胞经处理后,IFNβ-hucMSCs组和IFN-β组的细胞克隆形成率分别为(5.557±0.306)%、(8.200±0.436)%,均低于NC组(13.567±0.289)%、hucMSCs组(13.367±0.153)%、CON组(14.000±0.200)%,且IFNβ-hucMSCs组细胞克隆率明显低于IFN-β组,差异有统计学意义(P0.01)。IFNβ-hucMSCs组和IFN-β组的细胞相对迁移率分别为0.563%、1.150%,均低于NC组1.842%、hucMSC组1.823%、CON组1.850%,且IFNβ-hucMSCs组细胞相对迁移率明显低于IFN-β组,差异有统计学意义(P0.01)。IFNβ-hucMSCs组和IFN-β组72小时吸光度值低于NC组、hucMSC组、CON组,且IFNβ-hucMSCs组吸光度值亦低于IFN-β组,差异有统计学意义(P0.01)。(4)H226细胞经处理后,IFNβ-hucMSCs组和IFN-β组的细胞克隆形成率分别为(1.800±0.500)%、(3.100±0.100)%,均低于NC组(10.800±0.265)%、hucMSCs组(10.367±0.208)%、CON组(11.300±0.361)%,且IFNβ-hucMSCs组细胞克隆形成率明显低于IFN-β组(P0.01),差异有统计学意义(P0.01)。IFNβ-hucMSCs组和IFN-β组的细胞相对迁移率分别为0.307%、0.588%,均低于NC组1.115%、hucMSC组1.110%、CON组1.140%,且IFNβ-hucMSCs组细胞相对迁移率明显低于IFN-β组,差异有统计学意义(P0.01)。IFNβ-hucMSCs组和IFN-β组72小时吸光度值低于NC组、hucMSC组、CON组,且IFNβ-hucMSCs组亦低于IFN-β组,差异有统计学意义(P0.01)。结论:IFNβ-hucMSCs能显著抑制非小细胞肺癌细胞株A549和H226的克隆形成、迁移及增殖能力等肿瘤恶性生物学行为。
【图文】：

标准曲线,标准曲线,蛋白

图 1.蛋白标准品标准曲线10）待测样品蛋白浓度计算方法：同样条件下测得样品的吸光度值，然后代入标准曲线公式即可得出待测样品浓度。2.6.3 蛋白定量及高温变性1）根据 BCA 法绘制蛋白标准曲线后，测定提取蛋白液上清液的浓度；2）准备 96 孔板设置 2 组，每组 5 个复孔,同时，用无菌 PBS 液设置对照空白组，BCA （A）： BCA(B) 按照 50:1 比例配制混合液，每孔加入 200ul 混合液+18ulPBS+2ul 蛋白液，充分混匀，勿产生气泡，如果有气泡产生可以利用细针慢慢挑破，加好样后置于 60℃烘箱孵育 30min 或者室温 20-30min（随时间延长，颜色慢慢变深）；3）预热酶标仪 15min，上机检测蛋白液的的平均吸光度值，根据预先绘制的标准曲线计算蛋白液的浓度，记录好各待测样品的蛋白浓度；

细胞形态,细胞生长

结果1、HucMSCs 细胞体外形态学观察脐带组织剪碎，培养 2 周左右（个别情况延长至 3 周），倒置显微镜下可见脐带组织周围有梭形、长条状细胞生长，约 3 周左右可铺满瓶底。细胞消化传代后，原代 hucMSCs 细胞生长稍缓，无明显的梭形、旋涡形态。随着传代次数的增加，，细胞生长明显加快，到第 3 代时，细胞形成集落、成旋涡状、形态较一致、体积偏大、胞质丰富并且折光性强（图 2）。
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

【参考文献】