Fgf21基因敲除小鼠背部皮肤组织miRNA的差异表达分析及其靶基因预测

发布时间：2020-05-28 04:20

【摘要】：小鼠成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor21,Fgf21)作为一种重要的调控因子,对毛囊发育及生长周期具有重要作用。本实验室通过CRISPR-Cas9系统构建Fgf21基因敲除小鼠(Fgf21~(-/-)),并通过实验证明Fgf21基因参与毛发生长速度及毛囊直径的调控作用。MicroRNAs(mi RNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,以碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同诱导沉默复合体降解或阻遏靶mRNA的翻译。最新研究发现,miRNA对毛囊发育调控有重要作用。Fgf21基因在生物化学和遗传学上与miRNA虽然存在一定联系,但是Fgf21、miRNA以及毛囊生长发育机制的相互作用关系尚待明确。1 Fgf21~(-/-)小鼠模型的繁育及表型分析利用不同杂合子互交、杂合子与纯合子正反交以及纯合子互交的方式进行Fgf21~(-/-)小鼠模型的繁育,经过基因鉴定最终成功获得45只Fgf21~(-/-)小鼠。表型分析发现,Fgf21~(-/-)小鼠的产仔数目显著减少(p0.05),产仔雌雄比例、产仔初生重,整体及雌雄体重生长变化等生理指标均无显著差异(p0.05);通过表达谱分析,生理解剖学分析发现,与WT小鼠相比,Fgf21~(-/-)小鼠的各组织内脏均正常,尤其是Fgf21高表达的胰脏组织并无异常;通过石蜡切片及HE染色后进行的毛干数目统计发现,Fgf21~(-/-)小鼠的毛干数目显著少于WT小鼠(p0.05)。2 Fgf21~(-/-)小鼠表皮组织的miRNA测序以Fgf21~(-/-)小鼠和WT小鼠表皮组织为材料,miRNA测序共检出1249个不同长度miRNAs。差异miRNA表达分析的数据统计发现,差异显著的miRNAs共134个(p0.05),其中83个表达水平上调,51个下调;结合文献参考,从测序结果共筛选得到10个与毛囊生长发育调控相关的miRNAs,分别为mi R-377-3p、miR-335-5p、miR-214-5p、miR-148a-3p、miR-410-3p、miR-411-5p、mi R-376b-3p、mi R-376c-3p、miR-136、mi R-221-3p,之后利用荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,RT-qRCR)进行验证,与测序结果相一致。3 miRNA靶基因预测及生物信息学分析利用TargetScan、miRanda两款软件对显著性差异的134个mi RNAs(p0.05)分别进行靶基因预测后取其交集共得到105,886,298个靶基因。对显著差异mi RNA的靶基因进行GO和KEGG富集性分析,最终GO功能注释共得到20,557个靶基因,KEGG注释得到7,881个靶基因。通过GO富集性分析发现有1023个差异显著(p0.05)的基因功能属性,其中主要参与Protein binding、nucleus、integral component of membrane、cytoplasm和biological-process的5个功能属性过程;KEGG注释发现202条显著差异(p0.05)的信号通路被富集,其中164条信号通路差异极显著(p0.01),同时发现与毛囊发育相关的PI3K-AKT signaling pathway、P53 signaling pathway、Notch signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、TNF signaling pathway 5条差异极显著(p0.01)的信号通路。最终利用Cytoscape软件分别构建得到以验证成功的10个显著差异miRNAs为核心,集中调控与预测到的与毛囊发育调控相关靶基因的GO/KEGG-miRNA-靶基因的关联图。以上结果中异常表达的mi RNA可能参与了Fgf21对毛囊发育的调控。同时上述结果为梳理Fgf21、差异miRNA、靶基因在毛囊生长发育中的相互作用及其关系提供实验数据。
【图文】：

皮肤细胞,文献,功能,非编码

作为一种皮肤附属物，毛囊是在不同起源（上皮、间充质和神经外胚层）的细相互作用导致的一类组织特异性的产物[1]。毛囊的发育和产后再生的典型特点由于细胞活性的变化引起的，包括多个信号通路、转录因子和表观遗传调控共同作用的囊的生长发育主要通过三个不同的阶段，包括生长期，退行期和休止期[2,3]。毛囊产化的因素很多，包括干细胞的瞬时激活，后代细胞的增殖和分化，黑色素细胞的生成细胞凋亡等作用[4-6]（图1，引自文献Miller KJ, et al, 2015, MicroRNAs in skin tissue en而毛囊依赖性的变化主要涉及 Wnt、TGF-b/BMP、hedgehog、EDAR、FGF 和 IGF路的作用[7]。然而，在哺乳动物 DNA 总量中，蛋白质编码基因的组成非常小。人类转录过是由非编码 RNA 作用。非编码 RNA 的亚单位通过调节染色质的结构，，转录，翻译因表达。最近研究发现[8]，几个长非编码 RNA，比如 TINCR、ANKR 等，参与表皮层的形成过程[9,10]。然而，长非编码 RNA 在毛囊发育调控的角色发展和增长在很大未知。

成熟过程,毛囊

miRNA 在毛囊发育、循环和毛发色素沉着控制中的作用，重点的问题，并为研究 miRNA 在毛囊循环和发育中的作用提供了未来1 对 miRNA 的认识生成，miRNA 的生成多发生在细胞核和细胞质中[13]（图 2，引自文献 Bae of microRNAs in skin fibrosis）。其形成过程包括：（1）在细胞核中录聚合酶 II 作用生成初级转录物（pri-miRNA）；（2）在 Drosha 酶pri-miRNA 被切割后形成前体 miRNA（pre-miRNA）；（3）受体 expoA 转运到细胞质中；（4）Pre-miRNA 由 Dicer 处理，而受体 TRNA*复合体。（5）螺旋酶解除 miRNA/miRNA*复合体的双链，两条iRNA[14-16]。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】