嗜盐古菌Natrinema-IM-1的三个不同的蛋白酶基因的克隆及表达载体的构建

发布时间：2020-05-29 05:31

【摘要】：古菌是一种区别于真核生物和细菌的生物,分为广古菌和泉古菌,其中嗜盐古菌是广古菌的一类分支,在高于30%盐浓度中也能够生长。蛋白酶是催化水解蛋白质的一类酶,主要作用于氨基酸间的肽键。蛋白酶在医药化工、食品生产以及酿酒纺织等多个方面具有广泛的应用价值。为了研究古菌来源的蛋白酶,本研究根据GenBnak中与本实验室保存的嗜盐古菌Natrinema-IM-1属于同一属的Natrinema-sp-J7-2的全基因组序列,分析其基因组序列,设计了特异性引物,成功克隆出Natrinema-IM-1的3种不同的蛋白酶基因,并与pET-28a(+)原核表达载体进行连接,成功构建出3个重组表达载体,分别命名为pET-28a-MDP、pET-28a-SP、pET-28a-P。该研究为在大肠杆菌中进行嗜盐古菌的protease、serine protease、Metal-dependent protease表达,分析它们的酶活性打下了基础,也为进一步开发利用嗜盐古菌蛋白酶提供了实验数据及理论基础。
【图文】：

序列,学说,古菌

学家们对于地球上生命分类的认知[1]。1977 年，经过微生物学家 Woese 列研究提出：这些在极端条件下也能生存的微生物与细菌和真核生物有着别。且 Woese 等人在研究过后首次提出了 Archaebacteria 这一概念。他们核生物、原核生物和古菌这三类生物的 16SrRNA 序列后，提出了有关于“三域学说”，即地球上的生命不仅仅有原核生物和真核生物两大类，它们菌域（Bacteria）、古菌域（Archaea）、以及真核生物域（Eucarya）三部把 Archaebacteria 改为了 Archaea，这就使得古菌与细菌之间有了更加明。并由此构建了一个生物进化总树，如图 1。古菌是一类单细胞生物，它着非常独特的基因结构以及系统发育生物的大分子序列。大部分的古菌能端环境中生活，，有的古菌甚至能够存活在极高的温度（100℃以上）条件部分古菌能够在极端寒冷的环境中或者高盐、强酸强碱性的水中生存[1]。地球上古菌代表着生命的极限，它拓展了生物圈的范围，例如热网菌dictium）能够在高达 121℃的温度下存活下来，并正常生长，这是截止到的最耐高温的生物[3]。

质粒图谱,大肠杆菌,通用表达载体,盐碱湖

料所用菌株采自于内蒙古锡林郭勒盟东乌珠穆沁旗额吉淖尔盐碱湖、纯化、保存且经过鉴定的 Natrinema- IM-1 菌种。态细胞过程中所用到的大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌 DH5α 感受态细21（DE3）感受态细胞，分别购于天根生化科技有限公司、北京全公司。进行过程中，所要用到的质粒如下：pGM-T 克隆载体：由天根生化科技有限公司购买。pET-28a（+）质粒为本实验室所保存的通用表达载体，其质粒图谱
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;Q93

【参考文献】