缢蛏多巴胺受体基因的克

发布时间：2020-06-11 21:57

【摘要】：缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国重要的经济贝类,具有良好的发展前景。缢蛏的养殖先在南方兴起,而后由南到北发展,因其肉质鲜美,成为我国重要的经济贝类。多巴胺受体作为神经系统中重要的神经递质受体,为国内外学者所关注。多巴胺受体在感觉、运动、免疫、摄食、生长发育等生物学过程中都是重要的调节者和参与者。本研究通过RACE技术克隆得到缢蛏两个多巴胺受体基因,分析了基因的序列特征和时空表达特征;通过抑制剂筛选实验,基于多巴胺受体的药理学特征鉴定出多巴胺受体类型,并筛选出适合缢蛏D2类多巴胺受体的抑制剂和作用浓度。探究了多巴胺受体在损伤修复中的作用,基于筛选出的抑制剂探究鳗弧菌感染之后的免疫应答反应,并检测超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的含量变化,初步探究了D2类受体在缢蛏幼虫发育阶段中的作用。具体的研究成果如下:1缢蛏多巴胺受体的克隆及其选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)变异体从缢蛏转录组中得到两个多巴胺受体的基因片段ScDopR1和ScDopR2,经过RACE克隆获得两个基因的cDNA全长,ScDopR2-1基因全长2216bp,包含5’UTR区171bp,ORF区1814bp,3’UTR区231bp,共编码597个氨基酸残基;ScDopR2-2基因发现两个可变多聚腺苷酸化变异体,包含相同的ORF区和5’UTR区,ORF区长1440bp,编码479个氨基酸残基,5’UTR区长34bp,两个变异体的区别在于3’UTR区域的长短,ScDopR2-2b基因在polyA尾前比ScDopR2-2a基因多出了960bp,ScDopR2-2a变异体cDNA全长1824bp,ScDopR2-2b变异体cDNA全长2758bp。基因序列特征的分析和功能域的预测结果显示,两个受体均具备G蛋白偶联受体的典型结构域,以及具有较长的第三胞内环以及较短的C-末端,基于D2类受体的结构特征,初步推测两个多巴胺受体均为D2类多巴胺受体。2缢蛏多巴胺受体的时空表达特征分析利用荧光定量PCR检测了多巴胺受体在缢蛏成体组织的表达情况,结果表明,两个基因在斧足、肝、鳃、水管、唇瓣、外套膜、性腺中均有表达,ScDopR2-1在水管和唇瓣中的表达量最高,在斧足、鳃和外套膜中的表达量次之,在肝和性腺中的表达量最低。ScDopR2-2基因同源区段和ScDopR2-2b基因的表达模式基本相同,表达量最高的组织均为水管,在水管、鳃、斧足中的表达量显著高于其他组织。ScDopR2-2基因同源区段与ScDopR2-2b相比,组织的表达量也存在差异性,ScDopR2-2基因同源区段的表达量在鳃中高于斧足,而ScDopR2-2b基因在鳃中的表达与斧足的大致相同。多巴胺受体在缢蛏早期发育阶段的检测结果表明,ScDopR2-1基因在匍匐期表达量最高,在D型期表达量次之,在这两个时期出现两个表达量峰值,呈现出先增加再减少再增加再减少的表达模式。而ScDopR2-2基因在壳顶期的表达量最高,从卵裂期、担轮期、D型期表达量逐渐升高,到壳顶期表达量出现峰值,匍匐期又开始下降,匍匐期与稚贝期的表达量大致相同。3多巴胺受体抑制剂的筛选和多巴胺受体类型的验证在抑制剂筛选实验中,选取三种抑制剂多潘立酮(Domperidone,Domp)、舒必利(Sulpiride,Sulp)、盐酸氯丙臻(Chlorprothixene hydrochloride,Chlo)作为受试物,以各自溶剂为对照组,选取2小时和6小时两个时间点,通过检测不同抑制剂作用浓度(10~(-2)M、10~(-3)M、10~(-5)M)下缢蛏血清中的cAMP含量,以及采用荧光定量检测多巴胺受体基因的表达含量变化,对缢蛏多巴胺受体进行抑制剂种类和作用浓度的筛选。实验结果表明,注射2小时和6小时两个时间点,Chlo组的10~(-2)M的浓度下两个时间点基因表达量与对照组相比均显著下降,而cAMP也符合相比对照组上升的预期实验效果。从而筛选得到多巴胺受体的合适抑制剂为Chlo,筛选出适合的作用浓度为10~(-2)M。根据已知的药理学特征,抑制性配体刺激D2类受体的cAMP水平上升,进一步将多巴胺受体类型验证为D2类多巴胺受体。4缢蛏水管损伤实验和鳗弧菌感染实验缢蛏水管损伤实验,进水管损伤处理,不同时间点检测多巴胺受体的表达量,结果表明在进水管损伤后,表达量在12h、48h时呈显著上调,而在8h、24h、72h呈现显著下调,暗示缢蛏多巴胺受体基因参与水管损伤后的反应过程,其结果上升-下调-上升的表达模式,推测与多巴胺的补偿作用有关。鳗弧菌侵染实验中,设置三个实验组别:注射海水100ul(H组)、注射海水50ul+菌50ul(HJ组)、注射抑制剂50ul+菌50ul(CJ组),其中以H组为对照组。结果表明,ScDopR2-1基因在2h和4h的表达量上升,8h、12h、24h下降;三个实验组别中,CJ组比HJ组和H组的表达量低,CJ组在4h、8h、12h表达量比H组显著下降,而HJ组4h、8h比H组的表达量显著下降。ScDopR2-2基因的表达量也在注射的2h、4h表达量升高,在8h、12h、24h表达量下降,三个实验组别中,HJ组在2h和4h比H组显著下降,CJ组比H组在8h显著下降,CAT检测结果表明,免疫反应启动,抑制剂对免疫过程产生影响,多巴胺D2类受体参与调节免疫反应。5缢蛏多巴胺受体在早期发育中的作用利用受体抑制剂探究多巴胺受体在缢蛏早期发育中的作用,设置4种抑制剂作用浓度(10~(-2)M、10~(-3)M、、10~(-4)M、10~(-5)M),抑制剂处理缢蛏壳顶期幼虫,24h后,计算幼虫的长足率,结果表明,4种浓度抑制剂处理的幼虫长足率分别为20%,35%,40%和40%,而空白组为60%,D2类多巴胺受体抑制剂起到了一定的抑制效果,推断出多巴胺受体在缢蛏壳顶期幼虫的发育中起到作用。
【图文】：

多巴胺,结构式

体概述枢神经系统中重要的儿茶酚胺类神经递质，结构式如是儿茶酚胺的组成之一，与去甲肾上腺素（Norepinehrine）一起构成儿茶酚胺，多巴胺在儿茶酚胺类神经递的，是国内外学者对神经系统研究的重点。多巴胺的构，英文缩写为 DA，具有一个邻苯二酚结构（儿茶成（乙胺或其衍生物）[16]，多巴胺作为神经系统的重要意义也是广泛的，在生物体的胚胎发育[17]、运动[3；18]、要的调控作用。多巴胺的合成与代谢在生物体内有着

多巴胺受体,三维结构图

上海海洋大学硕士学位论文体的结构与种类是属于 G 蛋白偶联受体家族，具有 7 次跨膜结构疏水的跨膜结构域（TM1-TM7），其间通过胞内环N 端和 C 端[33]，，三维结构图如图 1-2。多巴胺受体员，G 蛋白偶联激酶是多巴胺受体重要的调节因的作用离不开 G 蛋白偶联激酶的调节[34]。随着第隆，人们对多巴胺受体的研究也进入了分子生物学
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】