转PeDREB2a和KcERF基因紫花苜蓿新材料的获得与抗性分析

发布时间：2020-06-11 23:04

【摘要】：紫花苜蓿(Medicago sativa L.)作为畜牧业发展中极为重要的牧草。其具有蛋白质含量富丰、适口性好等特点,是豆科植物中营养价值最高的牧草。我国苜蓿草产量供不应求,严重滞后了畜牧业的发展。干旱和盐胁迫严重影响了植物的营养生长与生殖生长,我国西北及华北地区旱地及盐碱土耕地所占面积比重较高。为了提高土地利用率以及减轻牧草与粮食作物间的竞争,利用分子育种手段培育抗旱耐盐的紫花苜蓿新品种,对我国草产业及畜牧业的发展具有深远意义。本研究依据优化了的紫花苜蓿高频再生体系,将从旱生植物胡杨及盐生植物秋茄中克隆的基因PeDREB2a::KcERF通过根癌农杆菌介导方法将其转入受体材料紫花苜蓿。现获得结果如下:(1)选取中苜1号、中苜3号、甘农4号作为植物材料;以叶片为外植体,通过筛选综合3种植物材料得到优化了的高频再生体系:最优愈伤组织诱导培养基为MS+0.2mg/L 6-BA+2 mg/L 2,4-D;最优分化培养基为1/2MS+20g蔗糖;最优生根培养基为1/2MS生根培养基+0.05mg/L IBA+0.05mg/L NAA。(2)经筛选以中苜1号和甘农4号作为受体材料,并以其叶片为外植体。依据优化后的再生体系,通过根癌农杆菌LBA4404介导将目的基因转入受体材料。试验得到转基因抗性(Kan)株系:中苜1号66株,甘农4号为27株。PCR检测阳性率分别为93.94%、88.89%。(3)通过RT-PCR检测证明转基因阳性植株在反转录水平上能够稳定表达;干旱胁迫及盐胁迫下24h,转基因株系中PeDREB2a、KcERF基因相对表达量在12h时最高;用20%PEG-3350和250mmol/LNaCl胁迫处理和生理指标检测,结果表明:转基因株系与野生型相比抗旱耐盐能力明显增强。
【图文】：

电泳图,农杆菌,菌液,电泳图

延伸 72°C 10min保存 12°C（3）琼脂糖凝胶电泳：反应结束后将 PCR 产物点样至 1.5%的琼脂糖凝中，110v，25min 进行电泳检测，以含有目的基因的质粒为阳性对照，以野生DNA 为阴性对照。3.3 结果与分析3.3.1 质粒载体转化根癌农杆菌 LBA4404 的 PCR 检测将含有目的基因的质粒通过农杆菌感受态转化入根癌农杆菌 LBA4404 中获得单克隆进行菌液扩大培养，同时以菌液为模板进行 PCR。将 PCR 产物进1.5%琼脂糖凝胶电泳（以 pCAMBIA2301-KcERF：：PeDREB2a 质粒为阳性对照农杆菌原菌为阴性对照）：

双价载体

兰州大学硕士研究生学位论文转 PeDREB2a 和 KcERF 基因紫花苜蓿新材料的获得与抗性分析行序列比对，，表明转入农杆菌 LBA4404 的目的基因序列和理论序列一致，已经将含有目的基因的质粒成功转入根癌农杆菌中。3.3.2 转基因紫花苜蓿的获得利用根癌农杆菌侵染法将具有PeDREB2a和KcERF双价基因的载体（图3.2）转化紫花苜蓿，并通过 Kan 筛选出多个转基因紫花苜蓿转化苗，利用 PCR 技术对获得的转基因植株进行检测，以 35S 启动子序列设计正向引物，目的基因序列设计反向引物。PCR 检测时阳性对照为含有目的基因的质粒，阴性对照为栽培品种基因组 DNA。通过 PCR 扩增后，110v，25min 凝胶电泳检测，拍照并统计结果。筛选出与阳性质粒 PeDREB2a：：KcERF 具有相同大小目的条带的紫花苜蓿植株。将检测到的转 PeDREB2a 和 KcERF 基因植株从培养瓶中移栽到土盆里，为进一步定植大田做准备。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S541.9

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