杜氏盐藻遗传转化体系的优化及油脂合成相关基因的修饰

发布时间：2020-06-12 01:14

【摘要】：杜氏盐藻(Dunaliella sallina)是一种光自养单细胞、无纤维质细胞壁的真核绿藻,能高水平合成β-胡萝卜素和油脂,是生产天然β-胡萝卜素和优质生物燃料的良好原料。特别是盐藻能在高盐环境下正常生长,大规模养殖不易发生病虫等污染,已成为现代农业中一种重要的特用生物资源。构建盐藻高效遗传转化体系并对目标基因进行精准修饰,可加快具突破性状盐藻优异种质的定向培育,促进建立以遗传改造的盐藻工程株系为平台生产高附加值特定化学品的绿色产业体系。为此,本研究以杜氏盐藻YC-011藻株为受体,以参与三酰甘油(TAG)生物合成的两个重要酶基因DGAT1a和GPAT为靶标,系统优化电击和基因枪遗传转化体系;分别将两个外源靶基因导入盐藻细胞并使其有效表达,以期修饰藻细胞TAG合成途径,进而培育富油盐藻优异工程株系。主要研究结果如下:1.细胞形态学和18SrDNA分子鉴定证实先期从山西运城盐湖分离获得的盐藻藻株YC-011 为杜氏盐藻(Dunaliella sallina)一个新株系。2.应用50μg/mL氯霉素、100μg/mL氨倫青霉素和100μg/mL头孢霉素组合,经3次除菌处理和5次继代培养,建立了杜氏盐藻无菌培养体系。3.针对表达载体携带抗除草剂草铵膦筛选标记(BAR基因),通过定量检测盐藻细胞对草铵膦的敏感性,确定固体和液体培养筛选阳性转化体的草铵膦浓度分别为20 μg/mL和 40 μg/mL。4.建立了优化的盐藻电击遗传转化体系:培养7天的盐藻细胞为最适受体,质粒浓度6μg/mL,电击参数为0.4kv和4ms。盐藻转化率达2.63%。,比现有电击转化效率提高约1.14 倍。5.建立了优化的盐藻基因枪遗传转化体系:以培养7天的盐藻细胞为受体,在靶距为6 cm、轰击压力为1300psi条件下进行1次轰击,转化效率达0.13‰。6.来源于高油植物斑鸠菊(Vernonia galamensis)的VgDT1a cDNA克隆编码催化TAG合成最后一步酰化反应的二酰甘油酰基转移酶(DGAT1a)。来源于模式微藻莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CrGPAT cDNA克隆编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(CrGPAT),它是磷脂酰甘油生物合成过程中的第一个酰基酯化酶。本文成功构建了分别表达CrGPAT和VgDGAAT1a的表达载体。7.GUS检测和其他分子检测显示,靶基因VgDGAT1a和CrGPAT已成功转入杜氏盐藻受体细胞并高效表达。8.生理生化分析表明,野生型盐藻油脂含量为15.3%,而转VgDGAT1a和CrGPAT基因盐藻油脂含量分别达36.9%和34.8%。可见,这两个限速酶基因的超表达能提高藻细胞贮藏油脂的合成积累。特别是油脂含量提高,并未引起蛋白和类胡萝卜素含量减低及其他不利表型。这些研究结果可应用于微藻高效遗传转化体系的研发、油脂等代谢途径的基因修饰和可编程控制产物合成积累的新型微藻的遗传构建。
【图文】：

生长均匀的盐藻单藻落。取单藻落扩繁培养，分别对其进行形态学和１８ＳｒＤＮＡ分子鉴逡逑定。逡逑在显微镜下观察细胞的形态特征（图２．１）。该藻细胞的颜色为黄绿色，单细胞呈逡逑椭圆形或梨形，有一对鞭毛，细胞内部有眼点，这是杜氏盐藻的典型特征，可初步判定逡逑为绿藻门，，盐藻属，表明试验已经获得一株杜氏盐藻系，命名为ＹＣ－０１１。逡逑＿逡逑图２．１杜氏盐藻藻株ＹＣ－０】１细胞形态逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｄ．邋ｓａｌｉｎａ邋ＹＣ－０邋＼邋１邋ｓｔｒａｉｎ逡逑以所获得的该盐藻１８ＳｒＤＮＡ目标序列为搜索序列，在ＮＣＢＩ数据库中进行ＢＬＡＳＴ。逡逑选出其他藻种序列，用邻接法构建系统进化树见图２．２。逡逑－１４－逡逑

长至对数期的盐藻液体培养基中。设置抗生素的浓度梯度为０、１００、２００、４００、６００、逡逑ＳＯＯｐｇ／ｍＬ，每个梯度设置６次重复。盐藻对氯霉素很敏感，低浓度下即可抑制其生长逡逑（图２．３），培养至第６天时，含有氯霉素２００邋ｎｇ／ｍＬ以ｈ的盐藻藻液颜色发黄，藻细逡逑胞分解，细胞内奔物流出。因此，必须选抒低浓度的Ｍy曀厣希砍�盐藻藻液屮的细菌。高逡逑浓度（８００邋ｐｇ／ｍＬ）头孢霉素和氨卞宵？霉素也未完仝抑制盐藻细胞生长（阁２．４，邋２．５）。逡逑因此，低浓度的氯霉素和高浓度的头孢霉素或氨苄青霉素均可用于杜氏盐藻除菌培养体逡逑系。逡逑＾逦＂邋Ｉ邋＊邋＇逦，邋ｔ邋／－逡逑４逦：）ｌ�

本文编号：2708774