家蚕抗病毒候选基因BmPGRP-S2和BmSCP1的功能研究及抗性素材制备

发布时间：2020-06-12 02:55

【摘要】：家蚕(Bombyx mori)作为一种具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,面临着严重的疾病威胁。家蚕质型多角体病毒(B.mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是蚕业生产中常见的、危害十分严重的病原之一,引起家蚕中肠型脓病,降低蚕茧产量及茧丝质量,最终给蚕业生产带来极大的经济损失。本实验室前期对感染BmCPV的家蚕cDNA模板进行转录组测序分析,在中肠筛选出多个抗性候选基因,其中包括家蚕肽聚糖识别蛋白S2(B.mori peptidoglycan recognition protein S2,BmPGRP-S2)和家蚕丝氨酸羧肽酶1(B.mori serine carboxypeptidase 1,BmSCP1)。在昆虫的先天免疫防御中,PGRPs作为模式识别受体能激活Toll和Imd信号通路诱导下游抗菌肽基因的表达去帮助宿主抵抗外来微生物的入侵。中肠是家蚕重要的免疫器官,能够分泌一些具有抗病毒活性的蛋白到肠液中,在感染初期抑制病毒的入侵。本论文将对BmPGRP-S2和BmSCP1的功能进行初步研究,并制备抗BmCPV转基因家蚕素材,分别在调控宿主先天免疫防御和病毒感染初期抑制BmCPV的增殖。主要获得以下的研究结果:1.增量表达BmPGRP-S2激活免疫通路提高家蚕对BmCPV的抗性基于基因组生物信息学和芯片数据分析,本研究从家蚕中肠中克隆得到BmPGRP-S2基因,多序列比对分析结果表明BmPGRP-S2蛋白不具备酰胺酶活性。构建BmPGRP-S2增量表达载体,瞬时转染BmE细胞,qPCR结果表明,增量表达BmPGRP-S2不会激活Toll和Imd信号通路。构建BmPGRP-S2转基因增量表达载体pb-PGRPS2,通过胚胎显微注射获得两个转基因品系PGRPS2-1和PGRPS2-2。qPCR和western blot结果显示,BmPGRP-S2增量表达成功,且被分泌到细胞外。抗性检测结果显示,当四龄起蚕以3×10~5个/头经口食下感染BmCPV后,PGRPS2-1、PGRPS2-2和对照死亡率分别为12%、16%和48%,PGRPS2-1和PGRPS2-2的死亡率分别比对照降低了36%和32%。qPCR检测感染后72 h家蚕体内病毒含量,结果表明,转基因家蚕体内的BmCPV含量显著低于对照。主要经济性状调查结果显示,PGRPS2-1、PGRPS2-2和对照之间的全茧量和茧层率均没有明显区别。对未感染病毒家蚕的Toll和Imd通路基因进行qPCR检测,结果显示,与对照相比,PGRPS2-1中Toll和Imd通路基因均未发生显著变化。感染病毒后,与对照相比,PGRPS2-1中Imd通路基因imd和relish被诱导上调表达,抗菌肽基因attacin2、gloverin2以及moricin基因的表达量升高,而Toll通路基因表达量无显著变化。这些结果表明增量表达BmPGRP-S2可以通过激活Imd通路诱导抗菌肽基因升高,有效提高家蚕的抗BmCPV能力,同时不会影响家蚕的经济性状。2.增量表达BmSCP1在感染初期抑制BmCPV提高家蚕抗性基于基因组生物信息学和芯片数据分析,本研究从家蚕中肠中克隆得到BmSCP1基因,多序列比对分析发现BmSCP1具有丝氨酸蛋白酶的催化中心,认为其是一个丝氨酸蛋白酶。构建BmSCP1增量表达载体,瞬时转染BmE细胞后,RT-PCR和western blot检测结果表明,BmSCP1属于分泌蛋白。而后,利用原核表达载体成功制备BmSCP1多克隆抗体。构建BmSCP1转基因增量表达载体pb-SCP1,通过胚胎显微注射获得两个转基因品系SCP1-1和SCP1-2。qPCR和western blot结果显示,BmSCP1在转基因家蚕中肠显著升高,且转基因家蚕肠液中BmSCP1含量明显高于对照。抗性检测结果显示,当四龄起蚕以3×10~5个/头经口食下感染BmCPV后,SCP1-1、SCP1-2和对照死亡率分别为22%、27%和45%,SCP1-1和SCP1-2的死亡率分别比对照降低了23%和18%。qPCR检测感染后72 h家蚕体内病毒含量,结果表明,转基因家蚕体内的BmCPV含量显著低于对照。全茧量和茧层率调查结果显示,表明增量表达BmSCP1不会影响家蚕的主要经济性状。经肠液处理后的病毒,最终以13×10~5个/头的病毒浓度添食四龄起蚕,qPCR检测感染后24 h家蚕体内病毒含量,结果显示,经转基因肠液处理后的病毒在家蚕体内含量比对照更低,而用BmSCP抗体处理后的肠液使病毒在家蚕体内含量比对照更高。这些结果表明,BmSCP1能够在感染初期(肠液中)抑制病毒。
【图文】：

示意图,原理,示意图,切割模

1. 文献综述double-stranded RNA，dsRNA）介导细胞内靶基因的 mRNA 发生特致相应基因沉默的现象[47]。该现象首先在植物中发现，之后陆续在有报道[47, 48]。RNAi 是宿主免疫机制中一条重要的防御通路[49, 50]，种不同的模式：转录抑制模式和 RNAi 切割模式[51]。在转录抑制模A 进入细胞后被 Dicer-2 切割成 21-23nt 大小的小干扰 RNA（small inter，siRNA），随后 siRNA 的一条链被整合进一种叫做 RNA 诱导的沉NA-induced silencing complex，RISC）中，最后 RISC 在 siRNA 的引 mRNA 结合，将该靶标 mRNA 降解。第二种模式是 RNAi 切割模侵为例，，病毒的 dsRNA 首先被细胞内的 Dicer-2 识别，随后被具有核ase III）活性的 Dicer-2 切割为 21 nt 大小的 siRNA。siRNA 与 RISC 一起装配形成成熟的 RISC 复合体，在碱基互补配对原则的指导下A 被切割降解，从而抑制病毒复制。

氨基酸序列,序列分析,酰胺酶

图 3.1 BmPGRP-S2 的序列分析Fig 3.1 The sequence analysis of BmPGRP-S2.划线：信号肽；红色字体：PGRP 结构域；黄色方框：Ami_2 结构域；*：终止密码子derline, the signal peptide; red words, the PGRP domain; yellow box, the Ami_2 domain; asterisk, the don.3.2 BmPGRP-S2 不具备酰胺酶活性将 BmPGRP-S2 的氨基酸序列放入 NCBI 中进行 Blast 比对，选取典型的不酰胺酶活性的 PGRP（sDmPGRP-SA、HsPGRP-IαC）和具有酰胺酶活性的 PGRBmPGRP-S5、DmPGRP-SC1b）以及 T7 溶菌酶的氨基酸序列进行多序列对比，发现 T7 噬菌体溶菌酶中的酰胺酶活性关键氨基酸半胱氨酸位点，在具备酶活性的 PGRPs 中同样为半胱氨酸，在无酰胺酶活性的 PGRPs 中被丝氨酸代。BmPGRP-S2 的第 171 个氨基酸同样被丝氨酸所取代。因此，BmPGRP具备酰胺酶活性。比对结果如图 3.2 所示。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S884.5

【参考文献】