表达维氏气单胞菌Malt基因重组干酪乳杆菌的构建及口服免疫学研究

发布时间：2020-06-12 04:58

【摘要】：维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种重要的水产病原菌,对水产养殖业造成巨大经济损失,因此研制水产疫苗是必需的,由于其接种受限因素较多,开发新型口服疫苗并选择合适抗原对水产疫苗的研制具有重要意义,麦芽糖孔蛋白作为一种特殊的外膜蛋白进行特异性结合,从而诱导机体释放细胞因子,因此可以作为候选抗原应用于基因口服疫苗的研究。本试验通过克隆A.veronii TH0426株Malt基因,并构建原核表达系统和细胞表面表达型重组干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Lc-MCS-Malt和分泌表达型Lc-pPG-Malt,通过Western blotting验证蛋白表达。结果显示:经过PCR能扩增得到1314 bp Malt基因片段,Western blotting条带清晰,蛋白大小45 kDa;通过荧光显微镜可见明显荧光信号的是Lc-MCS-Malt。为评估重组L.casei的免疫保护效果,本试验以鲫鱼作为试验动物,将重组L.casei经过乳糖诱导后混合海藻酸钠包被颗粒饲料投喂鲫鱼,在免疫前0 d、免疫后7、16、25和34 d采组织和血液,检测免疫相关指标;检测重组L.casei定植情况,单独设定试验组,连续投喂7 d,空腹28 d后无菌采集前、中和后肠,利用抗性平板进行计数;攻毒检测免疫保护率。采用ELISA方法检测血清中IgM、ACP、AKP、SOD、IL-10、IL-1β、TNF-α、IFN-γ指标。结果表明:各项指标经过口服免疫后都有所提升并差异明显,通过口服免疫方式鲫鱼能够诱导鲫鱼体液免疫分泌IgM和各项免疫指标;同时白细胞吞噬活性与分化能力都有所加强;利用qRT-PCR检测各组织IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ细胞因子的转录水平,结果表明:重组L.casei通过定植肠道刺激黏膜,使细胞因子的转录水平呈上调趋势,从而提升鲫鱼免疫力,定植情况也表明经过28 d的空腹,肠道内仍存在重组L.casei,表明其定植能力良好;攻毒后观察28 d,发现重组L.casei能有效缓解A.veronii造成的急性感染,在一定程度上起到保护作用。综上所述,本试验成功构建2种不同表达类型的重组L.casei,Lc-MCS-Malt和Lc-pPG-Malt,经过口服免疫的方式可诱导机体产生体液免疫应答,IgM含量上调并影响相关酶活性,同时促进白细胞分化和加强其吞噬活性,增强机体体液免疫应答,各组织细胞因子的转录水平也呈上调趋势,重组L.casei能有效保护鲫鱼并提高机体免疫力,试验结果为水产口服乳酸菌疫苗的研制提供理论基础。
【图文】：

ASY-Malt 的鉴定挑取疑似阳性菌落置于液体果进行琼脂糖凝胶电泳检测带，且大小一致。图 1-1 Malt 基因 PCR 扩增结L2000 DNA Maker；1-6 Malt 基g.1-1 The PCR amplification produA Marker；1-6: The PCR amplif

粒 pEASY-Malt 的鉴定平板上挑取疑似阳性菌落置于液体 LB 中培养，提，其结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图 1-2，质目的条带，，且大小一致。图 1-1 Malt 基因 PCR 扩增结果M：DL2000 DNA Maker；1-6 Malt 基因 PCR 产物Fig.1-1 The PCR amplification product of Malt2000 DNA Marker；1-6: The PCR amplification product of M
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.42

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 杨智景;李长红;张浩;苗亮;陈炯;;香鱼(Plecoglossus altivelis)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的分子克隆、鉴定及免疫相关性表达[J];海洋与湖沼;2015年06期

2 郑宗林;郑曙明;Delbert M.Gatlin Ⅲ;汪开毓;;嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究[J];淡水渔业;2015年05期

3 蔺凌云;潘晓艺;袁雪梅;姚嘉峗;徐洋;尹文林;许婷;郝贵杰;沈锦玉;;团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J];水产养殖;2015年07期

4 单晓枫;康元环;夏京津;龙继兵;陈龙;王惠;曹亮;孟庆峰;钱爱东;;不同动物源性维氏气单胞菌生物学特性比较研究[J];中国兽医杂志;2015年03期

5 曾范利;赵丹;康元环;陈龙;王惠;单晓枫;钱爱东;;不同动物源性维氏气单胞菌气溶素基因的克隆及比较分析[J];中国兽药杂志;2014年08期

6 赵敏;汪开毓;王均;陈德芳;黄凌远;王浩丞;;斑点叉尾源维氏气单胞菌对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因的检测[J];水生生物学报;2014年02期

7 孟庆峰;徐展;王伟利;;活载体疫苗的研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2013年19期

8 苟小兰;王利;刘港彪;;齐口裂腹鱼维氏气单胞菌的耐药性分析[J];西南民族大学学报(自然科学版);2013年05期

9 王海娟;王利;苟小兰;龙钟明;赵静;;鱼源维氏气单胞菌的耐药性研究[J];中国畜牧兽医;2013年08期

10 马苏;高艳春;;动物源细菌耐药性对动物细菌传染性疾病防治的影响[J];中国兽药杂志;2012年02期

相关硕士学位论文 前9条

1 贺桃凤;浙江省急性腹泻患者气单胞菌的流行与药物敏感性分析[D];浙江大学;2017年

2 秦杨蕾;鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及主要外膜蛋白的免疫原性研究[D];浙江万里学院;2015年

3 吴林怡;EGCG在草鱼体内的代谢及其对致病菌抑菌功效[D];安徽农业大学;2015年

4 葛铮;不同淡水鱼类维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析[D];吉林农业大学;2015年

5 向桢;中药有效成分对维氏气单胞菌毒力基因表达的影响[D];西南大学;2013年

6 宋雨泽;弧菌中整合接合元件的分子生物学特性研究[D];上海海洋大学;2013年

7 范腾飞;气单胞菌的毒力基因检测及环境因子对毒力基因表达的影响[D];合肥工业大学;2013年

8 夏飞;团头鲂源嗜水气单胞菌分离鉴定、检测及绿色荧光蛋白标记菌株的构建[D];南京农业大学;2012年

9 孟晓丽;STAg和霍乱毒素滴鼻免疫小鼠诱导的弓形虫特异性黏膜及系统免疫应答[D];山西医科大学;2005年

本文编号：2709035