BmCPV circRNAs功能及过表达BmCPV单基因对病毒增殖的影响

发布时间：2020-06-25 13:05

【摘要】：随着高通量测序技术和生物信息学的进步,越来越多的circRNAs(circular RNAs)被发现。并已证实一些circRNAs具有结合miRNAs、与RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)互作、参与基因转录、剪接调控等多种多样的功能,并在细胞增殖、分化、存活、衰老等许多生命过程和多种疾病的发生中发挥重要作用。家蚕细胞质型多角体病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)是CPV1型的典型种,能感染家蚕中肠细胞,导致家蚕发生质型多角体病引起养蚕歉收。病毒作为生物体的一大类,是人类、动物和植物重要疾病的病原,但至今没有病毒的转录产物形成circRNAs的有关报道。本研究中,通过高通量测序在BmCPV感染的家蚕中肠组织中发现有295种BmCPV来源的circRNAs。这些circRNAs分子大小分布在100-3800 nt,主要集中在200-1000 nt。circRNAs来源上在Bm CPV基因组的10个片段都有分布,但主要分布在基因组正链上。在对BmCPV circRNAs连接位点两侧的剪接信号进行统计后发现,病毒circRNAs的形成并不遵循典型的GT-AG拼接规则,并且在基因组正负链上也各不相同。GO和KEGG分析显示,BmCPV circRNAs可能通过与miRNA互作,调节细胞的蛙皮素受体信号通路、果糖2,6-二磷酸代谢过程、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路等。通过PCR产物测序、Northern blot进一步确认了BmCPV感染的家蚕中肠组织中存在BmCPV病毒来源的circRNAs。另外,本研究还发现在过表达BmCPV单基因的转化细胞系、BmCPV病毒粒子中都检测到病毒来源的circRNAs。这些新发现证明,BmCPV通过反向剪接形成功能性circRNA,为理解病毒基因的转录调节、病毒与宿主的互作提供了新的视角。为了更好地阐释病毒产生circRNAs的功能及作用机制,又对Bm CPV circ_048开展了更进一步的研究。qPCR检测发现circ_048是在BmCPV感染BmN细胞12小时后开始形成,并逐步累积。细胞免疫荧光结果显示,circ_048定位在BmN细胞质中。转染实验结果显示,上调circ_048水平可抑制Bm CPV的增殖,同时还上调了家蚕先天免疫相关基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白质磷酸酶的表达水平。另外,通过RNA pull down与质谱鉴定发现,circ_048有可能与Elongation factor 1-alpha、ATP synthase subunit beta等蛋白互作。信息学分析显示,circ_048具有IRES序列,具有编码6种多肽ORF-V,ORF-1,ORF-2,ORF-3,ORF-4和ORF-5的可能。进一步人工合成上述多肽的抗原肽、制备混合抗体,细胞免疫荧光实验结果显示,circ_048可能具有编码多肽的潜能。同时,还发现ORF-3、ORF-5起源的抗原肽都能够抑制BmCPV病毒的增殖,ORF-5起源的抗原肽可诱导细胞聚集、呈现病理变化。这些结果初步表明circ_048的RNA可通过与蛋白互作、编码小肽发挥功能。BmCPV的S1-S10 dsRNAs基因组片段为单顺反子,每个基因组片段在病毒增殖复制中的作用仍不清楚。研究了过表达BmCPV的vp3、vp7、polh及其相应的无起始密码子的vp3-mut、vp7-mut和polh-mut基因,及S2和S5片段对BmCPV增殖复制的影响,发现过表达vp7、vp7-mut都能促进BmCPV的增殖,过表达S5(NSP5)能够抑制BmCPV的增殖,但没有发现过表达vp3/vp3-mut、polh/polh-mut对病毒增殖的影响。qPCR检测结果显示,过表达vp3/vp3-mut、vp7/vp7-mut对细胞免疫、凋亡相关基因的表达无明显影响。另外,细胞流式发现,过表达S5(NSP5)还能够促进BmN细胞由S期向G2期转换。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S884.51
【图文】：

型多角体病毒( Bombyx mori cytoplasmic polyhedosis virus病毒科( Reovirdae )质型多角体病毒属( Cypovirus ) I 型病( dsRNA)病毒[1]。CPV 的结构特征V 是一种球状的病毒，具有二十面体结构（12 个顶点），在 12 个顶点处各有 1 个塔状突起[2]。突起被分为由 A 和与顶部的球状小体相连，B 突起与病毒衣壳直接相连[3]。图过负染和冷冻电镜技术得到的 BmCPV 的结构图。其中冷yo-electron microscopy，cryo-EM），简称冷冻电镜，是利用物大分子后，在低温中用透射电子显微镜对样品进行成像究发现 BmCPV 顶点上的 A 和 B 突起结构与 mRNA 的释的结构是一种中空的管状，所以研究者推断 BmCPV 的 起以及 A、B 突起之间的腔隙来进出病毒粒子。

mCPV 电镜下多角体形态（余学奎等Fig.1-2 Shapes of the BmCPV polyhed株系PV 多角体的形状、多角体在细胞中括野生型的 H 株和 8 株突变株（I、]：表 1-1 BmCPV 不同株系Table 1-1 Different strains of BmC多角体位置 细胞质、细胞核 细胞质 细胞核 细胞核

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 李晓东;李彦姝;赵大林;李丰;;p21活化激酶的生物学活性及其与肿瘤的关系[J];细胞生物学杂志;2006年03期

2 孙京臣,谭玉蓉,戴伟君,张勤奋,徐兴耀,张景强;家蚕质多角体病毒RDRP的免疫电镜定位研究[J];电子显微学报;2005年01期

3 钟伯雄;家蚕质型多角体病毒的三磷酸核苷酸结合蛋白[J];蚕业科学;2001年01期

4 余学奎,张勤奋,张景强;家蚕质多角体病毒(BmCPV)的结构研究[J];电子显微学报;1998年04期

相关博士学位论文 前1条

1 郭睿;BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV的感染应答[D];苏州大学;2015年

相关硕士学位论文 前3条

1 何蕾;家蚕质型多角体病毒（BmCPV）基因组片段7（S7）功能的研究[D];苏州大学;2014年

2 张轶岭;BmCPV与BmNPV多角体对异源蛋白的包埋特性研究[D];苏州大学;2011年

3 孟祥坤;BmCPV-SZ全基因组序列测定与分析及其多角体蛋白包装特性的研究[D];苏州大学;2010年

本文编号：2729177