温敏半矮生型桃PpTssd基因的精细定位及分子鉴定

发布时间：2020-07-09 10:21

【摘要】：桃[Prunus persica(L.)Batsch]新梢生长量大,树冠浓密,修剪量大,易造成树体营养浪费,增加生产成本,培育有限矮化、管理省工、适宜密植的生长型是桃遗传改良目标之一。本研究在明确表型响应温度和已有研究基础上(定位区间270 Kb),以温敏半矮生型桃为载体,开展内源BR响应温度变化、基因精细定位、杂种后代分子鉴定及候选区基因的SNP、InDel和结构变异分析等研究。主要研究结果如下:系统研究了温度对温敏半矮生型和普通生长型桃节间长度与内源油菜素甾醇的影响。采用双温度法(22℃和30℃)进行表型鉴定,‘09-8-25’×‘中桃白玉’杂交获得F_1代275株实生苗,22℃时表现为节间长度极短,呈极度矮化状态,而30℃时节间伸长,与普通生长型节间无明显差异的植株为温敏半矮生型(Temperature Sensitive Semi-dwarf Peach,PpTssd);22℃与30℃节间长度均较长且无明显差异的植株为普通生长型(Standard Type,ST)。研究不同温度(22℃、26℃和30℃)对PpTssd型植株茎尖油菜素甾醇水平的影响发现,在各温度处理的植株茎尖中均未检测到油菜素内酯成分;油菜素甾酮含量在3种温度处理条件下差异不明显,30℃时油菜素甾酮的鲜重含量仅为22℃的1.329倍;香蒲甾醇含量在各温度处理间具有显著差异,30℃处理条件下的香蒲甾醇含量是22℃的2.917倍,香蒲甾醇可能与突变性状有关。建立了一种高通量桃DNA提取方法。以‘09-1-112’(Pp Tssd)×‘中油桃8号’(ST)杂交F_1代500株实生苗为载体,利用1.2 mL八联排管结合改良CTAB法,提取桃幼嫩叶片中的基因组DNA。经检测,提取的DNA浓度范围约25 ng·μL~(-1)~200 ng·μL~(-1),OD260_(nm)/OD280_(nm)约为1.81~1.98,纯度和完整度较高。利用高分辨率熔解曲线进行验证,PpTssd型和普通生长型呈现明显不同的峰型,分辨率高;聚丙烯酰胺凝胶电泳的验证结果显示PCR扩增稳定,条带清晰,多态性较高;因此,提取的DNA可用于基于SNP/InDel标记的基因分型。利用本研究方法,每人每天可以完成1000个样品的DNA提取,可用于后续目的基因精细定位。基于双亲(‘09-8-25’‘中桃白玉’)重测序对PpTssd基因进行了精细定位。利用上述方法提取‘09-8-25’×‘中桃白玉’杂交F_1代275株实生苗基因组DNA,基于双亲深度测序,根据亲本的基因型与表型一致,开发SNP/InDel标记共38对,其中16对与目标性状连锁,将目的基因定位至Pp03-SNP_3480000与Pp03-SNP_3553771两标记之间,物理距离约74 Kb,共包含8个转录本,7个候选基因。基于荧光标记SSR毛细管电泳,对杂交后代6株重组单株进行分子鉴定。经检测,16对荧光SSR引物中,10对在双亲‘09-8-25’、‘中桃白玉’具有多态性差异,多态率为62.5%。毛细管电泳分析结果显示,6个交换单株均为‘09-8-25’×‘中桃白玉’杂交F_1代,分子鉴定率为100%。基于Sanger测序与二代测序数据,分析候选区间基因的遗传变异。比较AA、aa基因型植株精细定位区间genomic DNA序列,分析SNP、InDel和结构变异,发现在Purpe.3G049700基因5’UTR存在约377 bp缺失,该位点仅存在于PpTssd中,为可能的候选基因。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S662.1
【图文】：

树型图,垂枝,树型,赤霉素类

学院硕士学位论文常广泛，既可以直立生长又可延伸生长。短枝型桃的主干、枝条长度、分枝角度比较短，节间较短，叶片较小，该树型是优化树体结构进行遗传改良的重要资源）。垂枝型桃，树体高度几乎与普通生长型无差异，主要特点是枝条下垂，披散似，树冠呈伞状（Leuty et al.，1980）。国内外研究者对桃垂枝性状进行研究，沈向等（进行研究，通过外施赤霉素类似物对垂枝角度进行分析，发现植物内源激素 GA下垂的重要因素，该性状受显性单基因控制。意大利的 Bassi 科研团队对垂枝型在利用垂枝型桃构建一种类似梨 Lepage 体系（Bassi et al.，1994），为后人研究础。Hollender 等（2018）将控制垂枝性状的基因定位至第 3 号染色体，并对其为树型改良奠定基础。

遗传连锁图谱,遗传连锁图谱,主要性状

中国农业科学院硕士学位论文SSR 标记的开发成本较高，且耗时长，但桃基因组中的 SSR 标记具有交叉性，开发后，可应用于多个李属植物中，可以弥补开发成本较高的缺点（Cipriani et al.，1999；Downey et al.，2000；Hormaza et al.，2002；Sosinski et al.，2000）。Downey 和 Iezzoni 利用桃 SSR 标记分析黑樱桃（Prunusserotina）的遗传多样性（Downey et al.，2000）。Sosinski 开发的桃 SSR 标记，其中一部分可以应用于杏树（Prunus armeniaca）和欧洲酸樱桃（Prunus cerasus）遗传研究中（Sosinski et al.，2000）。从丰富 SSR 文库中筛选用于基因定位的多态性标记，耗时长，成本高；全基因组测序的完成为第三代分子标记的诞生提供了契机。SNP 标记（单核苷酸多态性），是单个碱基突变造成的多态性。基于高通量基因分型平台的建立，SNPs 被广泛应用于饱和遗传图谱的建立（Gundersonet al.，2009）。依托 Illumina 平台，高通量 SNPs 分析工具已经在李属植物中开发，并应用于品种基因分型和大规模基因分析（Peace et al.，2012；Verde et al.，2012；Micheletti et al.，2012）。基于 SNP 进行基因定位的成本仍比较昂贵，不适用于每一个实验室。由于 SSRs 的检测成本较低，且在基因组中丰富存在，其在种质遗传研究与指纹图谱构建方面具有更广泛的应用。

温度处理,植株

图 2.1 温度处理植株表型鉴定Fig.2.1 Phenotype identification based on temperature treatment图 2.2 不同温度 BR 类内源激素含量Fig 2.2 The BR content on different temperature treatment

【参考文献】