基于抗体多层次分析探讨过敏性疾病和自身免疫性疾病中B细胞作用及与HLA等位基因相关性

发布时间：2020-07-14 17:44

【摘要】：背景:过敏性疾病和自身免疫性疾病都是由遗传、免疫、环境等多种因素引发免疫功能异常所导致的疾病。其发病率呈逐年上升的趋势,是很重要的公共卫生问题。对两种疾病的病因和发病机制的研究尤其从免疫和遗传的角度,已经成为了研究的热点,对疾病的诊断和治疗有重大的意义。两种疾病的病理基础都与病理性抗体的产生有关,包括过敏性疾病中的sIgE,自身免疫性疾病中的多种自身抗体。这些病理性抗体均与B细胞和浆细胞有关,病理性抗体与抗原(变应原和自身抗原)的结合会引发一系列的病理反应(细胞因子释放、效应细胞活化、补体系统激活等),最终导致全身多器官的损害。病理性抗体在疾病的诊断中发挥着重要的作用,在一些自身免疫性疾病中,很多自身抗体的出现会比临床症状的出现或明确诊断早若干年。因此自身抗体的检测,可做为无症状患者的疾病风险评估的依据。在临床实践中发现,两种疾病的患者血清中的病理性抗体种类数有多有少,或表现为单一病理性抗体阳性,或表现为多种病理性抗体阳性,多种不同的病理性抗体合成是随机的还是存在必然性尚未可知,多种病理性抗体阳性的患者中,抗体的浓度不相同,是否可以用浓度高的抗体作为疾病诊断的指标有待研究证实。近年来,对病理性抗体来源的研究较为广泛,其中记忆性B细胞(包括短寿命和长寿命的记忆性B细胞),自身反应性B细胞,以及抗体合成过程中免疫球蛋白类型转化等都是研究热点。在过敏性疾病和自身免疫性疾病中,病理性抗体的合成与抗原(变应原和自身抗原)的刺激密不可分,抗原物质在体内的处理和递呈与HLA密切相关,故对两种疾病与HLA基因多态性的相关分析较为广泛。与过敏性疾病相关的HLA位点很多,某些药物引发的过敏也存在遗传易感性,比如青霉素等过敏与HLA-DRA相关。对多种类型的吸入性和食入性变应原引发的过敏研究发现,HLA-Ⅱ类分子与屋尘,蟑螂,食物添加剂,草莓,树木等多种物质引发的儿童哮喘相关,随着检测技术的发展,多种不同变应原相关联的HLA等位基因位点不断被找到,其中HLA-DQA1*01:01、HLA-DQA1*06:01、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*06:01与螨虫引起的过敏密切相关,HLA-DRB1*01、HLA-DQB1*05:01与艾蒿引发的过敏有关。但也有一些变应原尚未找到相关的HLA等位基因。在对SLE多年的研究中发现,HLA-Ⅱ类分子,尤其是HLA-DQA1、DRB1、DQB1发挥着更为显著和重要的作用,其中HLA-DRB1*15:01、HLA-DQA1*01:02、HLA-DQB1*06:02、DRB1*03:01、DQA1*05:01、DQB1*02:01、HLA-A*03:01、HLA-B*07:02和HLA-C*07:02、HLA-A*01:01、HLA-B*08:01、HLA-C*07:01等等位基因均与SLE的发生有关。遗传因素在这两种疾病的病理基础中起着重要作用,其作用机制涉及很多方面,但对病理性抗体种类与HLA等位基因相关性的研究尚无报道。目的:通过分析过敏性疾病和自身免疫性疾病病理性抗体数据,比较病理性抗体单一阳性实际值和理论值的差异,评估特征性抗体在疾病诊断中的价值,检测血清多种类型非相关抗体的水平,探讨淋巴细胞端粒相对长度与病理性抗体种类相关性,分析患者HLA-DRB1、HLA-DQB1等位基因型与病理性抗体的关系及其作用机制。方法:1.检测2409例过敏性疾病患者血清吸入性和食入性sIgE抗体(线性免疫印迹法,LIA),根据概率论的基本原理,提出了单一过敏比例理论值(TPM)概念和计算方法,并与单一过敏比例实际值(OPM)比较。提出特征性sIgE,通过ROC曲线法评估其诊断效能。2.检测643例自身免疫性疾病患者血清ANAIg G抗体(LIA),提出了单一ANA比例理论值概念和计算方法,并与单一ANA比例实际值比较。提出特征性ANAIgG,通过ROC曲线法评估其诊断效能。3.检测55例过敏性疾病患者和171例自身免疫性疾病患者血清中疾病非相关抗体,包括感染性抗体(弓形虫、巨细胞病毒、风疹病毒IgM抗体;梅毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒IgG抗体)、ANAIgG和sIgE,检测方法为化学发光法、电化学发光法、ELISA法和LIA法。4.检测33例过敏性疾病患者和36例SLE患者淋巴细胞端粒相对长度,同时检测年龄和性别相匹配的健康对照组端粒相对长度(实时荧光定量PCR法)。5.检测100例过敏性疾病和100例SLE患者HLA-DRB1和HLA-DQB1等位基因型(基因测序法,Sequence based typing,PCR-SBT),采用网上数据库搜索结合Discovery Studio(DS)软件,分析HLA等位基因型与病理性抗体种类数和是否患病的关系,比较相关HLA分子和无关HLA分子β链的氨基酸序列差异,并构建HLAβ链三级结构,比较分子的稳定性。结果:1.在过敏性疾病中,从多角度(性别、年龄、季节、疾病种类和过敏途径)比较OPM和TPM,OPM均显著低于TPM(p0.001)。特征性抗体ROC曲线下面积(AUC)为0.749。2.在自身免疫性疾病中OPM结果均显著低于TPM(p0.001)。SLE组ROC曲线下的面积值为0.916,类风湿性关节炎组ROC曲线下面积值为0.646,其他自身免疫性疾病组ROC曲线下面积为0.830。3.非相关抗体检测中,过敏性疾病组中抗巨细胞病毒IgM抗体和抗梅毒IgG抗体水平高于健康对照组,差异有统计学意义(p0.001);自身免疫性疾病组中抗弓形虫病毒IgM抗体和抗梅毒IgG抗体和抗丙肝IgG抗体高于健康对照组,差异有统计学意义(p0.05),sIgE检测结果显示自身免疫性疾病组阳性病理性抗体种类数均值(0.88)高于对照组阳性病理性抗体种类数均值(0.20),差异有统计学意义(p0.001);过敏性疾病组阳性病理性抗体种类数均值(2.37)高于对照组,差异有统计学意义(p0.001)。ANAIgG谱检测结果显示自身免疫性疾病组阳性病理性抗体种类数均值(2.47)高于对照组阳性病理性抗体种类数均值(0.05),差异有统计学意义(p0.001);过敏性疾病组阳性病理性抗体种类数均值(0.25)高于对照组,差异有统计学意义(p=0.04)4.SLE组端粒相对长度与健康对照组比较差异有统计学意义(p=0.011),过敏性疾病组端粒相对长度与健康对照组比较差异有统计学意义(p=0.043)。两种疾病组中端粒相对长度均缩短。SLE组端粒相对长度与ANA谱抗体阳性病理性抗体种类数负相关(B=-0.249,p=0.044),过敏性疾病组端粒相对长度与sIgE阳性病理性抗体种类数负相关(B=-0.250,p=0.048)5.过敏性疾病和SLE患者HLA高分辨等位基因型与病理性抗体种类数线性回归分析结果以及高分辨等位基因型与是否患病Logistics回归分析结果显示:过敏性疾病组中,与病理性抗体种类数有关的HLA分型有HLA-DRB1*01:02;与患病有关的HLA分型有HLA-DRB1*07:01。在SLE组中,与病理性抗体种类数有关的HLA分型有HLA-DQB1*02:02、HLA-DQB1*04:01、HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*12:10;与患病有关的HLA分型有HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*15:01。将上述相关HLA分子β链氨基酸序列与无关的HLA分子比较,分别构建相关/无关的HLADRB1和HLADQB1β链的三级结构,采用Minimization计算体系能量,评估分子稳定性,结果显示与疾病相关或病理性抗体种类数相关的HLADRB1和HLADQB1β链的稳定性均低于无关的HLAβ链。结论:1.在过敏性疾病和自身免疫性疾病中高比例的多重病理性抗体存在必然性。B细胞的异常活化和增殖是导致多种病理性抗体的产生的主要原因。特征性病理性抗体(sIgE/ANAIgG)在过敏性疾病和SLE的诊断中均有较好的诊断效能。2.过敏性疾病组某些抗体水平高于健康对照组,自身免疫性疾病组某些抗体水平也高于健康对照组,在这两种疾病中,与疾病相关和无关的多种类型的抗体同时存在异常,表明受累的B细胞较为广泛,其活化和增殖的特异性较差,故B细胞功能的紊乱可能是这两种疾病的发病基础。3.在对多重病理性抗体阳性的过敏性疾病和SLE患者端粒相对长度检测中发现其值均低于健康对照组,且与阳性病理性抗体种类数呈负相关。说明多种类抗体的合成是B细胞的过度活化和增殖的结果,并影响B细胞的衰老。4.本研究中与疾病发生和病理性抗体种类数相关的HLA-DRB1和HLA-DQB1分子β链稳定性低于无关的HLA分子,且这两种HLA分子的差异位点多数分布于抗原结合部位。因此相关HLA分子和无关的HLA分子结构不同,导致其与抗原多肽的结合的特异性和亲和力也可能存在不同,进而影响抗体的合成,导致疾病的发生和病理性抗体种类数量的变化。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593
【图文】：

吸入性,着色强度,抗体检测,过敏原

大连医科大学博士学位论文22图1-1. 吸入性及食入性sIgE抗体检测着色强度结果Figure 1-1. Results of sIgE intensity against inhalation and food allergens2.4 计算联合过敏比例实际值（observed proportion of compound-sensitization，OPC)和联合过敏比例理论值（theoretical proportion of compound-sensitization，TPC)在检测的20种过敏原中，有10种为吸入性过敏原，另外10种为食入性过敏原，本研究样本检测结果有单一吸入性过敏原或单一食入性过敏原阳性，也有吸入性过敏原和食入性过敏原均阳性的，称之为联合过敏。联合过敏比例实际值OPC=（联合过敏样本量/总样本量）×100%联合过敏比例理论值TPC=（单一吸入过敏比例×单一食入过敏比例）×100%=(单一吸入过敏样本量/总样本量) ×（单一食入过敏样本量/总样本量）×100%2.5 统计学分析实验所有数据均使用SPSS18.0软件进行统计(Statistical Package for SocialSciences, Chicago, IL, USA)。以p <0.05 作为判断是否有统计学意义标准。计数资料统计应用卡方检验

吸入性,抗体检测,过敏原

在食入性过敏原中，花生（10.00%）、海鱼组合1（8.80%）和淡水鱼组合1（7.06%）阳性率居于前3位（见表1-1）。图1-2. 吸入性及食入性sIgE抗体检测结果Figure 1-2. Results of sIgE against inhalation and food allergensNote:The result of the first strip (CN At-128-21): negative;The result of the second strip(CN At-128-18):ds1 class 4, w6 class 5;The third strip (CN At-128-20):f33 class 1, f88class 4, f27 class 4, f2 class 3, e2 class 4, e1 class 4, ds1 class 3, w6 class 4.本实验中，一个样本中过敏原阳性sIgE种类的数量为0-10。若仅有一种sIgE是阳性的，我们称之为单一过敏（占22.8%，见表1-2）。如果结果中有多个sIgE是阳性的, 则被称为多重过敏（占26.9%，见表1-2）。对于不同种类的过敏原单一过敏所占的比例是不同的（见表1-3）。对于每个过敏原而言，单一过敏所占的比例低于多重过敏所占的比例。其中凬草（u80）和霉菌组合1（ms1）中多重过敏所占的比例均超过95%。总体OPM（22.8%）低于TPM（38.6%），其差异具有统计学意义（p < 0.001，见表1-3）。在不同疾病组（过敏性皮炎

曲线,曲线,等级,尘螨

图 1-3. 特征性 sIgE ROC 曲线Figure 1-3. ROC analyses of trait sIgE detection(四) 讨论中，针对2409例样本均检测了20种不同的sIgE，并对其等级多数sIgE的阳性级别为1级，例如花生的sIgE阳性率最高，可1级的占77.59%，等级为2级的占14.94%。而尘螨组合1的sI别为5级，说明其sIgE具有较高的浓度。sIgE等级有助于预过敏症状。阳性等级为1级或2级sIgE的患者中，往往不表现3]。敏原检测结果显示单一过敏的比例低于多重过敏比例。进一别、年龄、季节和疾病种类进行分组后结果相同。关于多机制目前尚有争议：是交叉反应性抑或是共同过敏。本实

【参考文献】