鸟类和哺乳类OASL基因抑制A型流感病毒增殖的分子机制研究

发布时间：2020-07-14 19:34

【摘要】：病毒入侵宿主细胞后,天然免疫系统随即被激活,进而启动抗病毒免疫应答反应。2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶(2'-5'-O1igoadenylate synthetase,OAS)家族蛋白以其能够激活RNase L介导的病毒RNA降解通路,在天然免疫中发挥着重要的作用。在后生动物中,OAS基因可以分为OAS1、OAS2、OAS3和OASL四个超家族,OASL(OAS-like)基因作为OAS家族的非典型成员(OASL蛋白C端包含两个串联的UBL结构域),在哺乳动物中存在OAS酶活性的差异,而OAS酶活性的差异导致哺乳动物OASL蛋白在激活OAS/RNase L和OASL/RIG-I通路发挥抗病毒活性的差异。与哺乳类相比,大多数鸟类(如鸡和鸭等突胸目)OAS基因家族成员单一,只存在OASL一个成员;在平胸目鸟类(如鸵鸟和白喉(?)中,除具有OASL外,OAS1基因也被保留了下来。目前,关于鸟类OASL基因功能研究鲜有报道。首先对不同鸟类(鸭和鸵鸟)OASL蛋白的抗病毒活性进行分析,结果发现无论是高致病性(A/duck/Hubei/49/05)还是低致病性(A/goose/Hubei/65/05)H5N1禽流感病毒在稳定过表达鸭OASL的DF1细胞中的复制都显著降低(P0.05),鸭OASL对这两株流感病毒的抑制作用与鸭RIG-Ⅰ相当;进一步利用CRISPR/Cas9技术获得OASL敲除的DF1细胞系(DF1OASL-/-),结果发现鸭和鸵鸟OASL(dOASL和oOASL)都能显著抑制另外一株H5N1禽流感病毒(A/chicken/huabei/0513/2007)在细胞中的增殖,并且该毒株在DF1OASL-/-细胞中的复制显著增加(P0.05);此外,鸭和鸵鸟OASL都能显著抑制另外一株单股负链RNA病毒(NDV/LaSota)和两株双链RNA病毒(IBDV/B87和REOV/Z97/C10)在细胞中的增殖,并且这些病毒在DF1OASL-/-细胞中的复制显著增加(P0.05);鸭OASL还能够抑制单股正链RNA病毒(O/BY/CHA/2010)在IBRS2细胞中的增殖(P0.05);然而,无论是鸭还是鸵鸟OASL对两株DNA病毒(FPV/CVCC/AV1003和PRV/Henan/2014)在细胞中的复制都没有显著影响。以上研究表明,鸟类OASL能够广泛抑制多种RNA病毒的增殖,对DNA病毒的复制没有显著影响,这与某些哺乳类OASLs的抗病毒活性相似。接下来,对鸭和鸵鸟OASL蛋白的OAS酶活性进行检测,结果发现与小鼠Oasl2(mOas12)相似,鸭和鸵鸟OASL都具有OAS酶活性,并且能有效激活RNase L;进一步研究发现,鸟类和哺乳类OASL蛋白(dOASL、oOASL、hOASL和mOasl2)利用其自身3个天冬氨酸(同源于人OAS1蛋白Asp75-Asp77-Asp148)的突变可逆的开启或关闭RNase L通路;同时具有OAS 酶活性的OASL蛋白能够显著上调RNaseL和多个干扰素通路相关基因(如IFNα、IFNβ、STAT1和MX1等)的表达(P0.05);对OASL蛋白不同结构域截短体的研究发现,鸟类和哺乳类OASL激活RNase L通路具有UBL结构域的依赖性差异,与哺乳类不同,鸟类OASL蛋白发挥有效的OAS酶活性依赖其UBL结构域对dsRNA的结合作用,从而协同其OLD结构域激活并放大RNase L通路发挥抗病毒活性。本研究还发现,失去OAS酶活性的鸭和鸵鸟OASL-3D*突变体能够放大RIG-I信号,这与人OASL和小鼠Oasl2-3D*的研究相一致;相比较而言,同样失去OAS酶活性的鸭OASL-3K*和人OASL-R*K*K*突变体对RIG-I信号都没有放大作用,因此OAS酶活性失活是鸟类和哺乳类OASL蛋白放大RIG-I信号的必要不充分条件;另外,与人和小鼠相似,鸭OASL与鸭RIG-I蛋白存在互作,并且它们之间的相互作用不受自身3个天冬氨酸(同源于人OAS1蛋白Asp75-Asp77-Asp148)突变的影响,也不依赖于病毒的诱导,OLD结构域为OASL和RIG-Ⅰ互作的核心结构域;无论是鸟类还是哺乳类OASL对RIG-Ⅰ信号的放大作用都依赖其完整的UBL结构域。此外,与小鼠Oasl1不同,鸭OASL蛋白与鸭IRF7基因的5'UTR区不存在结合作用;同时鸟类可能不存在MBD1基因,因此鸟类不存在与人相似的OASL-MBD1直接互作机制。综上所述,本研究阐明了由鸟类和哺乳类OASL蛋白介导调控的OAS/RNase L和OASL/RIG-Ⅰ通路的分子交流机制。这些结果为鸟类和哺乳类OASL基因在流感等RNA病毒抗病中的深入研究提供理论依据。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q939.4
【图文】：

学位论文．，邋２０１４）。Ａ型流感病毒还是引发人畜共患病的重要病原体，一及近年来流行的Ｈ７和Ｈ６等亚型，不仅给养禽业带来巨大的经济胁（Ｈａｒｆｏｏｔ邋ａｎｄ邋Ｗｅｂｂｙ，２０１７）。总而言之，Ａ型流感病毒可以感重，而且给人类健康带来重大威胁。逡逑毒的形态结构逡逑毒颗粒呈球形或多形性，直径８０￣１２０邋ｎｍ，由外而内共有三邋Ｗｅｂｓｔｅｒ邋ｅｔａｌ．，邋１９９２）。最外层为来源于宿主细胞的双层类脂囊，中ＨＡ分子为三聚体构成的棒状纤突，ＮＡ分子为四聚体构成的蘑隙中还分布有少量基质蛋白（Ｍ２）构成的突起；中间层是由基的形态结构；最里层由８条单股负链ＲＮＡ及核蛋白（ＮＰ）缠绕个聚合酶蛋白（？８２、卩８１和？六）组成（图卜１）（８0仍＾以１１（１？也５蛋白质，约占病毒总重的７０％；邋ＲＮＡ占１％；糖类占５°／ｗ８％；脂膜上的脂类相似（Ｗｅｂｓｔｅｒｅｔａｌ．，邋１９９２）。逡逑Ｌｉｐｉｄ邋ｅｎｖｅｌｏｐｅ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋－逡逑ｆｒｏｍ邋ｈｏｓｔ邋ｃｅｌｌｓ逦？逡逑

Ｍ２逡逑Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｃｏｍｐｌｅｘ逡逑图１－１邋Ａ型流感病毒的结构模式图（Ｍｅｄｉｎａ邋ａｎｄ邋Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅ，邋２０１１＞逡逑１．２．２流感病毒基因组及其编码的蛋白逡逑１．２．２．１流感病毒基因组核酸特征逡逑流感病毒基因组由多个分节段的线性单股负链ＲＮＡ组成：Ａ型和Ｂ型流感病毒均包含８个节段，逡逑Ｃ型流感病毒包含７个节段；丨ＡＶ基因组核酸片段总长度为１３邋５８８邋ｎｔ邋（Ｂｏｕｖｉｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８）。Ａ型流感逡逑病毒ＲＮＡ节段的５＇和３味端序列保守并部分互补，其５＇末端序列为ＡＧＵＡＧＡＡＡＣＡＧＧ，３味端保逡逑守序歹｜Ｊ为ＵＣＧ（Ｕ／Ｃ）ＵＵＩＪＣＧＵＣＣ；邋Ｂ型流感病毒ＲＮＡ的５＇端序歹ｉｊ为ＡＧＵＡＧ（Ａ／Ｕ）ＡＡＣＡＡ，３１端保逡逑守序列为ＵＣＧＵＣＵＵＣＧＣ；邋Ｃ型流感病毒ＲＮＡ的５瑞保守序列为ＡＧＣＡＧ（Ｕ／Ｇ）ＡＧＣＡＡＧｙ端保守逡逑序列为ＵＣＧＵＣＵＵＣＧＵＣ，以上这些序列具有启动子活性。在一些缺陷型病毒粒子中存在相对较逡逑短的ＲＮＡ节段。逡逑１．２．２．２流感病毒编码的蛋白及功能逡逑１ＡＶ共包含８个线状单股负链ＲＮＡ节段，可编码至少１０种蛋白（Ｍｅｄｉｎａ邋ａｎｄ邋Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅ，逡逑２０１１），包括ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍｌ、Ｍ２以及非结构蛋白ＮＳ１邋和ＮＳ２（图邋１－１）；除此之逡逑夕卜

病毒基因组及Ｍｌ蛋白结合，介导ｖＲＮＰ的出核（Ｎｅｕｍａｎｎ邋ｅｔａｌ．，２０００）。逡逑１．２．２．３流感病毒编码的新蛋白逡逑由尸５／基因编码的两个新蛋白１＾１＋２和ＰＢ１－Ｎ４０邋（图１－３）。ＰＢ１－Ｆ２蛋白主要位于在线粒体上，逡逑与促凋亡和促炎症效应相关，ＰＢ１－Ｆ２蛋白同时具有核定位信号，能够与ＰＢ１互作而增强聚合酶的逡逑活性，另外ＰＢ１－Ｆ２也参与免疫应答的调节（Ｃｏｎｅｎｅｌｌｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１；邋Ｃｏｎｅｎｅｌｌｏ邋ａｎｄ邋Ｐａｌｅｓｅ，邋２００７；逡逑Ｄｕｄｅｋ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１１；邋Ｚａｍａｒｉｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００５）；邋ＰＢ１－Ｎ４０能够与ＰＢ２互作，影响聚合酶反应，同时ＰＢ１－Ｎ４０逡逑影响病毒的增殖效率（Ｔａｕｂｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．

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本文编号：2755394