宏基因组文库中芳香聚酮合酶基因簇的筛选与表达

发布时间：2020-07-14 20:44

【摘要】：环境中微生物资源的多样性,决定了其代谢产物生物活性的多样性。从可培养的环境微生物中已经发现了四环素,氯霉素,利福霉素等。随着这种传统的微生物分离培养方法的继续研究,发现找到的化合物的重复率高达99%,新结构化合物的获得越来越困难。研究表明,只有少于1%的微生物可在现有的实验室条件下分离培养。而绝大多数的微生物不能用传统的培养方法培养。宏基因组学技术是一种不依赖于微生物培养的技术,直接从环境样品中提取微生物全部遗传物质,对DNA末端修复、与合适的载体连接,转化到宿主菌中建立宏基因组文库。然后对文库进行筛选与分析,得到新的基因或生物活性产物。突破了微生物的培养瓶颈,是极具潜力的新方法。具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性的芳香聚酮化合物在医药领域有着广泛的作用。随着耐药菌的出现和治疗疾病的需要,新型芳香聚酮的发现非常迫切。但是由于绝大多数微生物不能在现有条件下培养,使芳香聚酮的发现受到极大的限制。不依赖微生物培养性的宏基因组学方法,直接克隆芳香聚酮的生物合成基因簇,使其在容易培养的宿主中异源表达,这为药物开发提供了方便。本课题利用构建的珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库,筛选获得含有芳香聚酮同源基因KSα的阳性克隆。并对含有完整芳香聚酮合酶基因簇的阳性克隆转化子在白色链霉菌中异源表达。首先根据芳香聚酮合酶基因中同源基因KSα设计简并引物,利用PCR扩增的方法,对珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中的质粒进行初步筛选。再根据简并引物筛选得到的序列与NCBI上已知的序列比对,对其结果正确的序列设计特异性引物,筛选文库菌液,最终得到26个含有芳香聚酮合酶同源基因KSα的单克隆。经过对单克隆的末端测序,对含有不完整聚酮合酶基因簇的单克隆根据末端序列再次设计引物,筛选获得重叠克隆。对含有完整聚酮合酶基因簇的阳性克隆转化子在白色链霉菌中异源表达。其中493编号阳性克隆转化子在白色链霉菌中异源表达,得到的发酵液经高效液相色谱检测发现有特异性峰。并对一金黄色葡萄球菌与枯草茅孢杆菌有抑制其生长的作用。获得了一个包含完整芳香聚酮化合物生物合成基因簇,即493编号的阳性克隆,同时进行了测序,片段大小为39896bp。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q933

【参考文献】