抗广谱性除草剂转基因油菜创制及抗性评价

发布时间：2020-07-15 00:59

【摘要】：油菜是我国最主要的油料作物之一。油菜生育期内田间草害严重,且单子叶和双子叶杂草混生,对除草剂的种类、用药剂量和用药时间均有严格要求,选择性除草剂往往难以达到理想的除草效果。因此,培育抗广谱性除草剂品种对提高油菜生产效益有重要价值。目前我国还没有具有自主知识产权的广谱非选择性抗除草剂油菜品种。本研究旨在利用农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化方法,将新型抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS~*和抗草铵膦基因RePAT~*分别转入甘蓝型油菜品系甲9707中,创制具有实用价值和自主知识产权的抗草甘膦和草铵膦转基因油菜。主要研究结果如下:(1)在转I.variabilis-EPSPS~*基因油菜植株获得过程中在30mg/L草甘膦选择压条件下,共得到了130株再生植株,其中126株为阳性植株,以目标基因为靶点的PCR检测证明,再生植株的阳性率为97%。(2)对转I.variabilis-EPSPS*基因油菜T _0代抗性处理结果表明,在用41%草甘膦异丙胺盐(农达)商品制剂稀释100倍后喷洒条件下仍能保持正常生长,对照完全死亡。(3)通过Southern blot检测,从96份转I.variabilis-EPSPS~*油菜T _0代植株中鉴定到43份单拷贝插入转基因材料。(4)采用Tail-PCR和Inverse-PCR方法,对T_0代43份单拷贝转I.variabilis-EPSPS~*基因材料进行T-DNA侧翼序列分析,共分离了31份材料的插入位点侧翼序列。这31份材料中共有14种具有不同插入位点的转化事件。(5)对7个T_1代转I.variabilis-EPSPS~*基因油菜家系的抗性鉴定表明,这些材料在稀释100倍的41%草甘膦异丙胺盐(农达)制剂喷洒条件下仍能正常生长,而对照在稀释200倍处理下全部死亡。单拷贝转基因家系处理后存活株与死亡株比例符合3:1的单基因分离比。(6)采用RT-PCR和Western blot方法,分别对部分T_1代转I.variabilis-EPSPS*基因油菜家系的叶片组织进行了基因表达和蛋白水平分析。所测转基因植株中目的基因I.variabilis-EPSPS*均有表达,但表达量在不同材料间有所差异。转基因后代材料均可检测到蛋白的表达,但不同材料之间蛋白表达水平存在明显差异,蛋白质水平和基因表达水平是一致的。(7)比较了来自三个不同转化事件的转I.variabilis-EPSPS~*材料和含有CP4-epsps基因材料的抗草甘膦表现。结果表明,含有不同抗性基因的两类材料具有相似的草甘膦耐受水平。(8)采用下胚轴为外植体的油菜转化技术,在2.5 mg/L草铵膦选择压条件下,获得了转RePAT~*再生植株93株,其中阳性植株有8株,阳性率为8.6%。对转RePAT~*基因植株T_0和T_1代植株抗性处理发现,部分植株可以在稀释100倍的18%草铵膦处理条件下存活。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.4
【图文】：

趋势图,不同类型国家,公顷,全球

际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）2016 年简报，转球转基因种植面积的 50%，玉米、棉花和油菜是仅次于转作物(clive James 2017)。截止 2018 年 3 月，全球共有 29植的主要类别转基因作物为大豆、玉米、棉花和油菜，这化 21 年间种植面积和趋势图见图 1-2。转基因技术能快速提高产量、改善营养品质以及经济的特t 2016, 2017)。在对转基因作物商业化应用 21 年间的综合程技术在农作物生产中从多方面带来了明显的价值效益：4 亿吨，产值增加 1678 亿美元，共节约 1.74 亿公顷土地，天海 2017)，节约了 6.2 亿千克的农药活性成分，使环境影响，帮助近两千万农户及其家庭缓解了贫困。(CliveJames2t 2016)

莽草酸途径,莽草酸,草甘膦,烯醇式丙酮酸

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位（毕业）论文）和莽草酸-3-磷酸（S3P），在 EPSP 合成酶的催化下，PEP 和 S-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸，5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸是莽要的中间物质(Amaro-Blancoetal2018)。当草甘膦经植物茎叶吸入由于草甘膦的化学结构与 PEP 相似，草甘膦会和 PEP 竞争，结合酸莽草酸-3-磷酸合成酶，但又不会影响 S3P 和 EPSPS 的结合，最草甘膦：EPSPS：S3P 的三元复合物(柳寒 2011)。该复合物非常稳正常功能，导致逆反应的速率非常慢，最终使得 EPSP 合成酶失活能正常进行，前体物质莽草酸大量积累，后续植物芳香族氨基酸不这将使得植物不能维持正常的生理代谢活动，从而导致植物生长异ill 2005, Duke and Powles 2008)，莽草酸途径和草甘膦的抑制作用

草铵膦,氮代谢,作用机制

.2 草铵膦作用机理草铵膦能抑制谷氨酰胺合成酶(GS)正常发挥活性功能，谷氨酰胺合成酶氮代谢途径中有重要作用，GS 是植物氮代谢途径中主要的酶，主要是及循环过程中起重要作用，可同化由硝酸盐还原、氨基酸代谢、根瘤光呼吸中释放出的铵，及时同化产生的铵后维持铵在植物体内的动态平因铵浓度过高对植物产生毒害作用，严重导致死亡。与草甘膦杀根不同先杀叶，施药后短时间内，草铵膦抑制 GS 的后果是不能及时同化氮，过量累积，对植物体内细胞和器官产生毒害作用，同时也严重影响光合作生长受到胁迫最终导致植物死亡，从而达到除草目的(Jalaludin et al 20军等 2004)。图 1-4 所示为植物氮代谢的一条重要途径和草铵膦作用位

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