α毒素诱导家蚕的基因表达模式及调控网络研究
发布时间：2020-07-15 11:12
【摘要】：家蚕在中国有着悠久的养殖历史,是畜牧业的重要组成部分。虽然现代养殖已经大幅度降低了养殖成本,但各种病害仍给桑蚕业造成巨大的经济损失。黑胸败血芽胞杆菌是家蚕一种常见的病原微生物,能够感染家蚕并导致细菌性败血症。在感染家蚕的过程中,黑胸败血芽胞杆菌分泌伴孢晶体毒素,损伤家蚕组织并促进细菌的入侵感染。α毒素作为伴孢晶体毒素的主要成分,对家蚕具有致死性,具有广阔的应用前景。本研究使用RNA-seq转录组测序,结合生物信息学的分析,以家蚕的中肠、血液、脂肪体和BmE细胞为材料,分析α毒素感染前后家蚕的基因表达模式以及调控网络,阐明家蚕对α毒素的免疫应答反应。1.转录组数据分析为了研究家蚕添食α毒素后的免疫应答反应,采用α毒素处理家蚕和BmE细胞,收集家蚕的中肠、血液、脂肪体和BmE细胞,各收集3个生物学重复,然后提取总RNA用于构建链特异的总RNA转录组测序文库,并进行转录组测序。总计使用48个样品进行测序并获得原始数据157Gb,平均每个样本含有30M reads。经过数据过滤与序列矫正,获得132Gb高质量数据,平均每个样本含有23M reads。通过计算样本的medTIN值,分析原始序列的完整性,结果表明样本无明显降解。然后将质控后的reads比对到silkDB数据库中的参考基因组,各样本的比对率达到80%左右。综上所述,所有样本的数据均达到转录组质控要求,可用于全基因组表达模式比较分析。根据与参考基因组的比对结果,计算基因的表达量。结果表明不同组织内基因的表达分布情况类似,即大部分基因的表达量较高,集中在32TMM附近,并且在毒素处理后基因表达量的整体分布会发生改变,如脂肪体、中肠和血液的基因表达量均呈现上升的趋势,表明α毒素的处理会导致基因表达量发生变化。PCA分析显示,PC1-3的方差百分比分别为:45.06%、26.92%以及18.07%,不同组织相互分离,并且组织之间并没有明显的相关性,表明不同组织样本的基因表达模式存在明显差异。2.差异基因分析基于负二项分布模型,计算所有基因的差异表达概率,并将差异倍数大于2且FDR值小于0.05的基因定义为差异基因,共鉴定到952个差异基因。在中肠、脂肪体、血液和BmE细胞中差异基因的数量分别为:238、555、295和32,上调基因的数量分别为:113、344、159和16,下调基因的数量分别为:125、211、136和16。差异基因在各组织中的分布情况显示,11个基因同时在中肠、血液和脂肪体上调,31个基因在不同组织的表达量变化情况不一致。以上结果说明,α毒素的处理会导致许多基因的表达量发生改变,并且不同组织响应毒素的基因存在明显差异。对差异基因进行功能富集分析,共富集到89个不同的GO分类,包括36个生物过程,46个分子功能以及7个细胞成分。差异基因富集的生物学途径主要为:海藻糖合成途径、柠檬酸运输途径以及肽聚糖的分解代谢过程;分子功能主要为:柠檬酸跨膜运输活性、UDP合成活性、金属蛋白酶活性以及氧运输活性;细胞成分主要为:胞外区域、肌蛋白复合物以及线粒体内膜的转运蛋白复合物。不同组织中差异基因的富集分析结果差异较大,中肠上调的基因主要富集在酪氨酸激酶信号通路,中肠下调的基因主要富集在几丁质代谢途径,而脂肪体上调的基因则具有肌醇三磷酸活性。综上所述,α毒素会影响家蚕体内许多信号通路,且不同组织对α毒素的响应方式存在明显差异。3.差异表达lncRNA分析为了分析lncRNAs对α毒素免疫应答,将质控后的数据比对到BmncRNA数据库,该数据包括了 6281个家蚕的lncRNAs。通过表达量计算,获得3888个lncRNA的reads count大于10,表达量集中在16TMM,相对于编码基因,其总体表达水平相对较低。将差异倍数大于2且FDR值小于0.05的lncRNA定义为差异lncRNA,共鉴定到353个差异表达的lncRNAs,在中肠、血液、脂肪体和BmE细胞中的个数分别为:103、85、193和19,其中上调的个数为:58、42、87以及11,下调的个数为:45、43、106以及8。差异lncRNA的表达量集中在32TMM,并且处理后整体呈现下降的趋势。通过计算Jensen-Shannonscore对比差异lncRNAs和编码基因的组织特异性,结果显示lncRNAs比编码基因具有更高的组织特异性。4.共表达网络分析为了构建共表达网络,采用差异表达的lncRNAs和编码基因的表达量进行共表达网络分析,共鉴定到两个主要的共表达模块。其中一个模块含有118个节点,包括113个基因和5个lncRNAs。另一个模块含有87个节点,包括83个基因和4个lncRNAs。集群分析结果显示,两个模块共含有139个集群,分别为82以及57,规模最小为2,最大为40。其中9个lncRNA形成51个集群,并有5个lncRNA能形成1个以上集群,最多的为bmlnct_1109,能形成32个集群。通过集群分析提取模块中规模最大的集群,结果显示其中一个集群内有一个编号为AK382731的lncRNA,而另一个集群内只含有基因。暗示差异基因可能受到lncRNA的调控,或者与lncRNA共同行驶生物学功能。富集分析的结果显示,其中一个模块内的基因所参与的生物学途径为几丁质代谢途径,另一个模块并没有富集到特定的生物学途径,但是该模块内的基因所编码的蛋白与器官的解毒过程相关,包括了丝蛋白酶、细胞色素P450等。共表达网络分析显示lncRNAs和编码基因存在潜在的相关性,为lncRNA在家蚕免疫应答中的功能研究提供参考。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S881.2
【图文】：
１．邋１．３细菌感染宿主模式逡逑细菌是种类最繁多的生命体，并且能够适应不同的生态环境，包括家蚕的体内。逡逑病原细菌成功感染宿全需要几个步骤，包括附着宿主细胞，在组织中繁殖，然后以某逡逑种方式入侵细胞，之后是细胞内增值，进而可能传染其他组织。细菌通过多种方式与逡逑宿主进行相互作用，包括单体结构的附着物、入侵因子以及高度复杂的大分子等，例逡逑如ＩＩＩ型分泌系统和有伸缩性的ＩＶ型菌毛［１＜３］，该过程能够导致宿主细胞功能的改变以逡逑及疾病的发生。逡逑为了成功侵入宿主，细菌演化了许多的方法，其中之一就是分泌毒素。一些细菌逡逑霉素，包括穿孔毒素，能够在细菌、植物和哺乳动物的细胞膜形成孔洞＃＿导致细胞膜逡逑通透性的增加并对组织造成损伤［１１］。细菌毒素还能够扰乱免疫系统促进感染和疾病的逡逑进程，并导致宿主产生强烈的免疫应答，甚至死亡。细菌毒素的作用机＿多种多样，逡逑对其进行研究有利于病害的防治以及毒素的应用。毒素的潜在应用包括开发新的生物逡逑杀虫剂、构建抗虫植以及应用至ｌｊ医药行业等》逡逑Ｂｂ邋｜邋＃逦？邋１逡逑Ｚ、
图１．邋１黑胸败血芽胞杆菌和伴孢晶体。（Ａ）黑胸败血芽孢杆菌；（Ｂ）伴孢晶体毒素。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｂｏｍｂｙｓｅｐｉｉｅｕｓ邋ａｎｄ邋ＰＣ．邋（Ａ）邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｅｉｔｓ；邋（Ｂ）邋ｐａｒａｓｐｏｒａｌ邋ｃｒｙｓｔａｌ．逡逑１．邋１．３细菌感染宿主模式逡逑细菌是种类最繁多的生命体，并且能够适应不同的生态环境，包括家蚕的体内。逡逑病原细菌成功感染宿全需要几个步骤，包括附着宿主细胞，在组织中繁殖，然后以某逡逑种方式入侵细胞，之后是细胞内增值，进而可能传染其他组织。细菌通过多种方式与逡逑宿主进行相互作用，包括单体结构的附着物、入侵因子以及高度复杂的大分子等，例逡逑如ＩＩＩ型分泌系统和有伸缩性的ＩＶ型菌毛［１＜３］，该过程能够导致宿主细胞功能的改变以逡逑及疾病的发生。逡逑为了成功侵入宿主，细菌演化了许多的方法，其中之一就是分泌毒素。一些细菌逡逑霉素，包括穿孔毒素，能够在细菌、植物和哺乳动物的细胞膜形成孔洞＃＿导致细胞膜逡逑通透性的增加并对组织造成损伤［１１］。细菌毒素还能够扰乱免疫系统促进感染和疾病的逡逑进程，并导致宿主产生强烈的免疫应答，甚至死亡。细菌毒素的作用机＿多种多样，逡逑对其进行研究有利于病害的防治以及毒素的应用。毒素的潜在应用包括开发新的生物逡逑杀虫剂、构建抗虫植以及应用至ｌｊ医药行业等》逡逑
行更多的处理。逡逑数据量是衡量测序质量的标准之一＊只有Ｓ数据量足够才能检测到表达量较低的逡逑转录本＾图３．１Ｃ是过滤前后序列数量的对比，其中灰色代表过滤前，黑色代表过滤后，逡逑所有样本过滤后的序列数均在２３Ｍ以上ｐ家蚕的基因组相对人类的基０组来说比较小，逡逑因此不需要达到３０Ｍ的测序深度，目前的测序深度己经能够用于检测低表达f埖淖煎义媳尽ｅ义显诒Ｖな萘砍渥愕耐保剐枰Ｖげ庑虻闹柿浚嵬迹常保氖鞘菰ご砗螅义嫌醒局行蛄兄柿康姆植记榭觥４油贾锌梢钥闯觯砗笏行蛄械钠骄柿糠植季义显冢常耙陨希粲诟咧柿渴荩蛄械那安扛蟛康牟庑蛑柿拷系汀Ｕ馐遣庑蚴葜绣义铣＜南窒螅赡苡胄蛄星安康募罨植疾ǘ洗笥泄兀⒉换岫院笮治霾跋欤掊义弦虼宋吮Ｖば蛄杏泻鲜实某ざ龋辉俣孕蛄薪薪囟獭ｅ义希常玻彩莸奶卣麇义希铃危洛义希保埃埃义希穑澹蝈澹螅澹瘢酰澹睿悖邋澹牵缅澹悖铮睿簦澹睿翦义
本文编号：2756416
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S881.2
【图文】：
１．邋１．３细菌感染宿主模式逡逑细菌是种类最繁多的生命体，并且能够适应不同的生态环境，包括家蚕的体内。逡逑病原细菌成功感染宿全需要几个步骤，包括附着宿主细胞，在组织中繁殖，然后以某逡逑种方式入侵细胞，之后是细胞内增值，进而可能传染其他组织。细菌通过多种方式与逡逑宿主进行相互作用，包括单体结构的附着物、入侵因子以及高度复杂的大分子等，例逡逑如ＩＩＩ型分泌系统和有伸缩性的ＩＶ型菌毛［１＜３］，该过程能够导致宿主细胞功能的改变以逡逑及疾病的发生。逡逑为了成功侵入宿主，细菌演化了许多的方法，其中之一就是分泌毒素。一些细菌逡逑霉素，包括穿孔毒素，能够在细菌、植物和哺乳动物的细胞膜形成孔洞＃＿导致细胞膜逡逑通透性的增加并对组织造成损伤［１１］。细菌毒素还能够扰乱免疫系统促进感染和疾病的逡逑进程，并导致宿主产生强烈的免疫应答，甚至死亡。细菌毒素的作用机＿多种多样，逡逑对其进行研究有利于病害的防治以及毒素的应用。毒素的潜在应用包括开发新的生物逡逑杀虫剂、构建抗虫植以及应用至ｌｊ医药行业等》逡逑Ｂｂ邋｜邋＃逦？邋１逡逑Ｚ、
图１．邋１黑胸败血芽胞杆菌和伴孢晶体。（Ａ）黑胸败血芽孢杆菌；（Ｂ）伴孢晶体毒素。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｂｏｍｂｙｓｅｐｉｉｅｕｓ邋ａｎｄ邋ＰＣ．邋（Ａ）邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｅｉｔｓ；邋（Ｂ）邋ｐａｒａｓｐｏｒａｌ邋ｃｒｙｓｔａｌ．逡逑１．邋１．３细菌感染宿主模式逡逑细菌是种类最繁多的生命体，并且能够适应不同的生态环境，包括家蚕的体内。逡逑病原细菌成功感染宿全需要几个步骤，包括附着宿主细胞，在组织中繁殖，然后以某逡逑种方式入侵细胞，之后是细胞内增值，进而可能传染其他组织。细菌通过多种方式与逡逑宿主进行相互作用，包括单体结构的附着物、入侵因子以及高度复杂的大分子等，例逡逑如ＩＩＩ型分泌系统和有伸缩性的ＩＶ型菌毛［１＜３］，该过程能够导致宿主细胞功能的改变以逡逑及疾病的发生。逡逑为了成功侵入宿主，细菌演化了许多的方法，其中之一就是分泌毒素。一些细菌逡逑霉素，包括穿孔毒素，能够在细菌、植物和哺乳动物的细胞膜形成孔洞＃＿导致细胞膜逡逑通透性的增加并对组织造成损伤［１１］。细菌毒素还能够扰乱免疫系统促进感染和疾病的逡逑进程，并导致宿主产生强烈的免疫应答，甚至死亡。细菌毒素的作用机＿多种多样，逡逑对其进行研究有利于病害的防治以及毒素的应用。毒素的潜在应用包括开发新的生物逡逑杀虫剂、构建抗虫植以及应用至ｌｊ医药行业等》逡逑
行更多的处理。逡逑数据量是衡量测序质量的标准之一＊只有Ｓ数据量足够才能检测到表达量较低的逡逑转录本＾图３．１Ｃ是过滤前后序列数量的对比，其中灰色代表过滤前，黑色代表过滤后，逡逑所有样本过滤后的序列数均在２３Ｍ以上ｐ家蚕的基因组相对人类的基０组来说比较小，逡逑因此不需要达到３０Ｍ的测序深度，目前的测序深度己经能够用于检测低表达f埖淖煎义媳尽ｅ义显诒Ｖな萘砍渥愕耐保剐枰Ｖげ庑虻闹柿浚嵬迹常保氖鞘菰ご砗螅义嫌醒局行蛄兄柿康姆植记榭觥４油贾锌梢钥闯觯砗笏行蛄械钠骄柿糠植季义显冢常耙陨希粲诟咧柿渴荩蛄械那安扛蟛康牟庑蛑柿拷系汀Ｕ馐遣庑蚴葜绣义铣＜南窒螅赡苡胄蛄星安康募罨植疾ǘ洗笥泄兀⒉换岫院笮治霾跋欤掊义弦虼宋吮Ｖば蛄杏泻鲜实某ざ龋辉俣孕蛄薪薪囟獭ｅ义希常玻彩莸奶卣麇义希铃危洛义希保埃埃义希穑澹蝈澹螅澹瘢酰澹睿悖邋澹牵缅澹悖铮睿簦澹睿翦义
本文编号：2756416
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