对海南地区Bt菌株cry基因的鉴定、克隆及蛋白活性分析

发布时间：2020-07-16 03:01

【摘要】：目前在农业生产上主要依赖于化学农药,但是化学农药的使用带来了一系列的问题,因此使用一种具有特异、高效的生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)占主要地位,它广泛用于农业、林业及医学害虫的防治,其生产量和使用量占微生物农药的95%以上。苏云金芽胞杆菌可产生晶体蛋白和可溶性分泌蛋白,并且这些蛋白对靶标害虫具有高效特异的杀虫活性,因此在全球范围内得到普遍应用。正是这种杀虫蛋白的效用,也促使我们识别和鉴定出具有不同特异性的新的杀虫蛋白,从而在土壤环境中分离出更多的新型Bt资源,并且具有杀虫特性的Cry蛋白已经广泛被应用于农业害虫的防治,但目前仍然有其他的Bt蛋白还未有明确其靶标害虫。近年来由于在我国农业害虫的逐年加重,农作物的产量逐年下降。因此,现在急需寻找新型的杀虫活性基因这对我国农业害虫的防治具有非常重要意义。本文针对我国棉田鳞翅目害虫进行了菌株的筛选与杀虫基因克隆的研究。本研究的主要内容如下:(1)从中国海南地区采集到2300份土壤,分离出Bt菌株755株,其伴胞晶体类型有长双锥体形、短双锥体形、球形等,本实验根据已知的基因序列设计通用引物,通过聚合酶链式反应(PCR)方法,对2300株Bt菌株基因池DNA混合样品进行PCR鉴定。序列分析结果表明,这些Bt菌株基因池中含有2种cry2类基因,分别为cry2Ab基因和cry2Ag基因,扩增得到cry2Ab和cry2Ag的全长基因序列,分别为1902bp和1891 bp,已提交cry2Ab基因序列(Gen Bank登录号为KX357382)和cry2Ag基因序列(Gen Bank登录号为KX236449)。分别构建p EB-Cry2Ab和pEB-Cry2Ag表达载体,并在大肠杆菌BL21中成功表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,两种Cry2类蛋白均可以表达出分子量为70 kDa的杀虫晶体蛋白。将得到的两种杀虫晶体蛋白分别对鳞翅目(Lepidoptera)害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)进行生物活性的初筛测定,选取初筛活性较高的蛋白再进行复筛,复筛结果显示,成功表达的两种蛋白对小菜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性。(2)对实验室保存的海南地区菌株Bt BJH500、Bt BJH498进行基因鉴定,通过PCR鉴定发现其中含有cry4基因,再利用全长引物进行扩增,结果获得cry4-like全长基因序列。该序列已提交Gen Bank注册,登录号为KX244950。将得到的全长基因与p EB载体相连,构建表达载体在大肠杆菌BL21中成功表达,通过SDS-PAGE结果显示,可以在大肠杆菌中表达出分子量为43 kDa的晶体蛋白。将表达得到的晶体蛋白对小菜蛾和棉铃虫进行生物活性初步测定,其校正死亡率都较低,结果分析该蛋白对小菜蛾、棉铃虫均无显著杀虫活性。本研究针对我们实验室保存的海南地区菌株,进行菌株筛选、基因型的鉴定与杀虫活性的测定,获得有效菌株Bt BJH500和Bt BJH498。通过聚合酶链式反应(PCR)方法成功克隆杀虫基因3个。研究结果发现两种Cry2类蛋白对三种鳞翅目(Lepidoptera)害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)具有一定的杀虫活性。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S482.39;Q78
【图文】：

氨基酸序列,级分,蛋白,命名系统

东北农业大学理学硕士学位论文最后，同源性高于 95%的蛋白在第四等级里进行类别区分[18]。不管怎样，这种法可为每个独立编码蛋白的基因序列进行分类，因此，尽管有些蛋白可能在第四但实际上它们的氨基酸序列也可能是相同的[18]。这种命名系统通常用于 Bt 蛋素（Cry 和 Cyt）和分泌蛋白（Vip 和 Sip）的命名与分类。到目前为止，共Cry1-Cry74，Cyt1-Cyt3，Vip1-Vip4，Sip）包括 349 种模式基因。

氨基酸序列,杀虫晶体蛋白

尽管结果发现这九种毒素蛋白的氨基酸序列和杀虫特异性差别较大，但它们活性区域却具有一致的结构：即大部分ICPs的结构域主要包括Domain I、Domain II和Domain III（图1-3）。Domain I位于活性Cry蛋白的N-末端于1991年由Li等首次报道[30]。它包括一个α-螺旋束，在这个α-螺旋束中，一个疏水的 -螺旋中心由有6个反向平行的 -螺旋围绕着形成（图1-3）。有研究认为Domain I会与毒素寡发生聚化、插入细胞膜以及空洞形成有关[31]，在Domain Ⅱ中是由三个反向平行的β-折叠构成一个β棱柱（ -prism）结构（图1-3）[30]，其中两个折叠片暴露在外侧表面的而且是由希腊钥匙的四条单链组成的。这种结构被形象地称为“Greek Key”拓扑结构，这种结构由由四个反向平行的 -折叠片段构成。还发现与幼虫中肠蛋白的特异结合有关是暴露在外面的Loop区域[31]。近年来有研究表明，某些氨基酸的位点或区域与杀虫特异性有很大的关系是因为Cry蛋白的DomainⅡ结构上的Cry毒素结构结构。Cry毒素结构是DomainⅡ中变化最多的结构域[32]，DomainⅡ的该区域与免疫球蛋白的相似性足可以表明毒素蛋白的DomainⅡ区域在与受体结合中起着非常重要的作用[30]

晶体形态,苏云金芽胞杆菌,晶体形态,光学显微镜

Bt BJH500 Bt BJH498图 3-1 光学显微镜下苏云金芽胞杆菌的晶体形态Fig. 3-1 The crystal shape of Bt strains under a microcope3.2 标准菌株基因组提取对从海南地区筛选出的 755 株标准菌株进行基因组的提取，经琼脂糖凝胶电泳检测如图 3-2。从电泳结果图中可以看出，提取的基因组质量和浓度较高，将提取质量高的基因组作为模板用于后续 PCR 扩增实验。

【参考文献】