热带假丝酵母ctpxa1基因缺失菌的构建及对长链二元酸积累的影响
【图文】：
试剂盒(上生工生物工程股份有公司)胶回收制得的pxa1p1片段与kanr片段，保存于20℃用。1.2.2片段的建以胶回收制得的pxa1p1片段与kanr片段为模，pxa1pF1和kanR1为引物进行重叠延伸PCR扩增，PCR扩增件为：1)95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃火30s，72℃延伸3.5min，5个循；72℃延伸2min；2)95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃火30s，72℃延伸4.5min，30个循；72℃延伸10min，4℃保存。扩增得到长度为2148bp的同源重组片段pxa1p1-kanr，过程如1所示，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，保存于20℃用。图1C.tropicalis1798-pxa1工程菌的构建流程Fig.1FlowchartofconstructionofC.tropicalis1798-pxa1.
程成等/热带假丝酵母ctpxa1基因缺失菌的构建及对长链二元酸积累的影响：010-64807509：cjb@im.ac.cn241盐酸调pH至3.0，加Н100mL乙醚，摇瓶至十二碳二元酸完О溶解于乙醚中，静置30min后取50mL乙醚提取液于100mL烧杯内，在通风橱中吹去乙醚，得白色十二碳二元酸。将提取到的二元酸加Н25mL95%中性乙醇溶解，加Н2滴酚酞，用标准氢氧化钠溶液滴定，记消耗的氢氧化钠积，计算十二碳二元酸的产量。2结果与分析2.1氨基酸序列比对目前关于酵中pxa1p基因功的研究主要集中在S.cerevisiae和Y.lipolytica中。通过NCBI分检S.cerevisiae中Pxa1p(870aa)和Y.lipolytica中YlPxa1p(NCBINo.AJW19428.1，930aa)蛋白的氨基酸序列，并用DNAMAN进行序列比对分析，结果如2所示。分析S危珻.tropicalis中的CtPxa1p长度为732aa，短于S.cerevisiae和Y.lipolytica中对应的蛋白序列，同时虽然C.tropicalis中的CtPxa1p序列与S.cerevisiae和Y.lipolytica中对应的蛋白序列都属于ABC跨膜转运蛋白家族，并定于过氧化物图2氨基酸序列相似性分析Fig.2Putativeaminoacidsequencealignment.
CR扩增，扩增产物用1%琼糖凝胶电泳进行验证，获得大为2200bp左右的带(4)，与理论值2169bp接近，表明pxa1p1-kanr与pxa1S紊粗刈椋瓿蒫tpxa1基因的。2.4C.tropicalis1798、C.tropicalis1798-pxa1菌株中ctpxa1基因表达量提取C.tropicalis1798、C.tropicalis1798-pxa1总RNA进行定量RT-PCR，扩增产物用1%琼糖凝胶电泳进行验证，结果如5所示，通过QuantityOne软件对灰度值进行分析，ctpxa1基因在C.tropicalis1798、C.tropicalis1798-pxa1灰度值比值为2.03，证明ctpxa1基因在C.tropicalis1798-pxa1的表达量下。图3PCR扩增目的基因Fig.3PCRamplificationofthetargetgene.(A)PCRproductofhomologyarmspxa1p1gene.M:markerDL5000;1 2:550bpDNAfragmentofpxa1p1genefromC.tropicalis1798.(B)PCRproductofkanrgene.M:markerDL5000;1 2:1600bpDNAfragmentofkanrgenefromplasmidpPIC9K.(C)ProductofoverlapPCR.M:markerDL5000;1 2:2100bpDNAfragmentbyoverlapPCR.
【参考文献】
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【共引文献】
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8 桂秋芬;姚嘉e
本文编号：2779005
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