Cupriavidus gilardii CR3中双组份编码基因copSR的铜抗性调控机制研究

发布时间：2020-08-04 18:56

【摘要】：双组份信号系统是细菌中最常见的信号传导系统,能够感应、传导外界环境刺激,调节菌体内对应的基因适应性表达,在细菌抵抗不良环境的过程中发挥着重要的作用。Cupriavidus gilardii CR3是典型的重金属抗性基因位于染色体上的细菌,对铜的最小抑菌浓度(MIC)是3 mM。以往研究表明贪铜菌Cupriavidus metallidurans CH34、Cupriavidus necator N-1、Cupriavidus taiwanensis LMG 19424的双组份信号传导系统丰富多样、功能强大且参与重金属抗性调控机制。目前,关于C.gilardii CR3的双组份信号系统的研究尚无报道。本文首次研究了C.gilardii CR3全基因组的双组份信号系统分布特征,克隆鉴定了铜抗性双组份信号基因(copSR),运用实时荧光定量PCR测定了不同铜离子浓度胁迫下copSR及其调控的结构基因(copB)在mRNA水平上的差异表达情况。此外,通过生物信息学技术对双组份蛋白CopSR进行了结构分析、功能预测和KEGG代谢通路分析。基于上述研究,本文分析了贪铜菌复杂多样的信号传导机制,揭示了C.gilardii CR3铜抗性调控机制。本文研究结果可为C.gilardii CR3在铜污染水体和土壤修复的潜在应用提供重要的理论参考。主要研究结果如下:(1)通过比较基因组学分析,结果表明C.gilardii CR3全基因组共有96个基因编码双组份信号蛋白,组成了22个双组份信号系统,其中与铜抗性相关的双组份信号系统比例最大。C.gilardii CR3的双组份信号系统与同属C.metallidurans CH34、C.necator N-1、C.taiwanensis LMG 19424拥有10个相同的HK蛋白功能域和7个相同的RR蛋白功能域,维持贪铜菌间的保守特性。此外,C.gilardii CR3含有4个HK特有蛋白功能域和1个RR特有蛋白功能域,特异性地适应C.gilardii CR3的生存环境。(2)克隆结果表明双组份信号系统编码基因copSR确实存在于C.gilardii CR3中。测序及NCBI序列比对结果表明,C.gilardii CR3中的copSR基因序列与标准copSR基因序列完全相同,copS为1404 bp,copR为687 bp。Smart数据库分析表明,copS编码的蛋白CopS为C.gilardii CR3的双组份感应蛋白CopS(WP_053820945.1),copR编码的蛋白CopR为C.gilardii CR3的双组份反应调节蛋白CopR(NP_251499.1)。菌株CR3的CopS蛋白与Cupriavidus sp.HPC(L)的感应传导激酶同源性较高,菌株CR3的CopR蛋白与Cupriavidus sp.HPC(L)的调控因子同源性较高。(3)通过实时荧光定量PCR研究C.gilardii CR3在Cu2+刺激下目标基因copSRB的差异表达情况。结果表明,C.gilardii CR3在0.5 mM、1 mM、2 mM Cu2+胁迫2 h后,copSR表达量上调,且随着铜离子浓度增加而显著升高(P0.001),2 mM达到最大。C.gilardii CR3在不同浓度Cu2+胁迫下,各生长阶段的基因表达规律不尽相同。在0.5mM Cu2+胁迫下,copSR基因表达量在7 h(对数生长早期)达到最大;1 mM Cu2+胁迫时下copSR基因表达量在4 h(迟缓生长晚期)达到最大;2 mM Cu2+作用下copSR在2 h(迟缓生长早期)表达量达到最大。即铜离子浓度越高,copSR达到最大表达量的时间越短。copB的表达受copSR调控,与copSR表达趋势一致。(4)生物信息学分析表明,C.gilardii CR3的CopS为跨膜组氨酸激酶,具有功能域HATPase_c、HisKA和HAMP信号域,第255位氨基酸残基为保守的组氨酸残基,发生自磷酸化反应。C.gilardii CR3的Cop R为胞质调控蛋白,具有功能域REC和trans_reg_C,第51位为天冬氨酸残基,接收来自CopS的磷酸基团。C.gilardii CR3的CopS三级结构与Thermotoga maritima的反应调节蛋白DrrD结构相似,CopR蛋白三级结构与Caulobacter crescentus的组氨酸激酶DivL结构相似。综上,C.gilardii CR3含有丰富多样的双组份信号系统,C.gilardii CR3中的copSR为铜抗性双组份信号系统。铜抗性双组份蛋白CopS和CopR共同感应和传导C.gilardii CR3外界环境中铜离子刺激,调控下游铜抗性结构基因表达,维持菌体胞内铜离子平衡,对C.gilardii CR3抵抗外界环境中的铜离子威胁起到至关重要的作用。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78
【图文】：

周质空间,质膜,系统模型,外模

nas syringae 的 cop 系统模型图（CM:质膜；PS:周质空间；OM:外l of cop system in Pseudomonas syringae (CM: cytoplasmic membranspace; OM：outermembrane This figure is from [27])

分布情况,双组份,基因组,白色

第三章铜抗性双组份信号基因 copSR 的克隆和序列分析.1 引言在第二章 C. gilardii CR3 的全基因组双组份信号系统分析中，我们发现 C. gilarR3 中铜抗性相关的双组份信号系统基因（copSR）所占比例最大，为 C. gilardii C铜抗性提供生物信息学依据。copSR 基因在 C. gilardii CR3 中的分布情况如图 3-1（信息来自 NCBI）。copS(1404bp)和 copR(687bp)相邻，转录方向相同，与结构基copABCD 等）转录方向相反。本章以 copSR 基因为研究对象，对 C. gilardii CR3 copSR 进行克隆及序列分析，以期为第二章的基因组分析提供实验依据，并为后续奠定基础。

电泳图,琼脂糖凝胶电泳,子菌落

图 3-2 DNA 琼脂糖凝胶电泳图图 3-3 PCR 产物电泳图Fig. 3-2 Electrophoresis analysis of DNA Fig. 3-3 Electrophoresis analysis o3.3.2 克隆子鉴定包含目的片段copSR的单克隆子菌落(分别挑取6个阳性单菌落)的P泳结果如图 3-4 所示。所挑取的六个单菌落 PCR 产物电泳条带清晰。M2 1 2 3 4 5 6 M2M2：DL2000 DNA1：单菌落-12：单菌落-23：单菌落-34：单菌落-45：单菌落-56：单菌落-6

【参考文献】