茶树硫酸盐转运蛋白基因对硒的响应及CsSULTR3.5功能分析

发布时间：2020-08-09 14:43

【摘要】：硒的丰缺与人体健康密切相关,硒缺乏或过量都会对机体产生不利影响。人类饮食中大部分的硒是直接或间接从植物中获得的,植物可食用部分硒含量的高低直接影响人体膳食的硒摄入水平。在世界范围内,缺硒现象十分普遍。茶树具有较强的富硒能力,是理想的补硒资源。深入研究茶树对硒的吸收和转运机制,对于茶树硒生物强化和遗传改良具有重要意义。本研究基于茶树基因组和转录组测序结果,从中筛选出硫酸盐转运蛋白基因家族的多条EST序列,利用RT-PCR克隆获得了8个茶树硫酸盐转运蛋白基因的cDNA序列。利用实时荧光定量PCR技术研究了CsSULTRs在不同硒/硫处理条件下的表达变化及其在茶树不同组织的表达情况,探讨了茶树CsSULTRs对硒的响应机理。并对CsSULTR3.5进行了功能初步分析。主要研究结果如下:1.生物信息学分析表明,CsSULTRs都含有硫酸盐转运蛋白典型的SLC26A/SulP transporter结构域和STAS结构域。根据与其他物种SULTR同源性远近,将克隆获得的CsSULTRs分别命名为CsSULTR1.1(GenBank登录号:KY963791)、CsSULTR1.2(GenBank登录号:KY963792)、CsSULTR2.1(GenBank登录号:KY977431)、CsSULTR3.1(GenBank登录号:KY963793)、CsSULTR3.2(GenBank登录号:KY977432)、CsSULTR3.3(GenBank登录号:MF596178)、CsSULTR3.5(GenBank登录号:MG792805)、CsSULTR4.1(GenBank登录号:KY963794)。2.qRT-PCR研究结果表明,茶树中的CsSULTRs对不同SeO_4~(2-)/SO_4~(2-)处理的响应模式不同。其中,根中的CsSULTR1.1受短时缺硫诱导显著上调表达,根中的CsSULTR1.2对加硒处理有特异性响应;而茎中的CsSULTR2.1及第3亚家族的4个成员均受缺硫处理及加硒处理诱导;CsSULTR4.1的表达则不受外界SO_4~(2-)/SeO_4~(2-)供应水平的影响。3.组织表达特异性分析结果表明,CsSULTRs在茶树的地上部和地下部、营养器官和生殖器官中均有表达。其中,在幼龄茶树中,CsSULTR1.1和CsSULTR1.2主要在根中表达;CsSULTR2.1以及第3亚家族的4个成员均在茎中高表达;CsSULTR4.1主要在茎和叶中表达。而成年茶树中,CsSULTR1.2在茎中高表达;CsSULTR2.1在花中的表达量最高;CsSULTR4.1主要在生殖器官(花和果)中的表达。此外,研究发现,CsSULTR3.5在各组织的表达丰度较其他基因高。4.构建CsSULTR3.5-GFP融合表达载体,瞬时转化水稻原生质体,通过激光扫描共聚焦观察发现CsSULTR3.5定位于细胞质膜。克隆获得CsSULTR3.5基因起始密码子(ATG)上游2 516 bp的启动子序列,顺式作用元件预测显示该区域存在多种激素响应元件、光响应元件、胁迫应答元件以及结合位点,表明该基因的表达受多种因素调控。对不同生长阶段的pCsSULTR3.5::GUS转基因拟南芥进行GUS染色,研究发现,除种子和子叶外,转基因株系各部位都有GUS活性,其中维管组织中的GUS活性最高。CsSULTR3.5过表达转基因拟南芥在不同硒/硫处理条件下的表型均与野生型拟南芥无显著差异。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S571.1
【图文】：

电泳图,茶树,硫酸盐,电泳图

图 2.1 茶树硫酸盐转运蛋白基因 CsSULTRs 克隆电泳图Fig. 2.1 The electrophoresis result of the cloning of the sulfate transporter gene CsSULTRs in tea plantM：DL2000 maker；A：CsSULTR1.1； B：CsSULTR1.2； C：CsSULTR2.1；D：CsSULTR3.1；E：CsSULTR3.2； F：CsSULTR3.3； G：CsSULTR3.5； H：CsSULTR4.12.2.2 CsSULTRs 序列分析表 2.2 茶树硫酸盐转运蛋白氨基酸组成和理化性质分析Table 2.2 The analysis of amino acid composition and physicochemical properties of all identified CsULTRs genes基因名称Gene name登录号Accession No.开放阅读框ORF（bp）氨基酸Amino Acids理论等电点pI分子量Mw（kDa）CsSULTR1.1 KY963791 1 977 658 8.99 72.58CsSULTR1.2 KY963792 1 977 658 9.04 72.44CsSULTR2.1 KY977431 1 962 653 9.12 71.54CsSULTR3.1 KY963793 1 980 659 7.61 72.39CsSULTR3.2 KY977432 1 953 650 8.79 71.21CsSULTR3.3 MF596178 2 061 686 9.01 74.91

茶树,无信号,信号肽,硫酸盐

14图 2.2 CsSULTRs 亲/疏水性分析Fig. 2.2 Prediction for hydrophilicity or hydrophobicity of CsULTRsSignalP4.1 Server 信号肽预测结果显示，克隆获得的 8 个茶树硫酸盐转运蛋白均无信号都属于非分泌蛋白。

信号肽,磷酸化位点

15图 2.3 CsSULTRs 信号肽预测Fig. 2.3 The Signal peptide prediction of CsULTRsTMHMM 跨膜螺旋结构域预测结果显示，CsSULTR1.1、CsSULTR1.2、CsSULTR2.1、CsSULTR3.1、CsSULTR3.2、CsSULTR3.3、CsSULTR3.5、CsSULTR4.1 分别具有 10、10、8、10、12、9、11、12 个跨膜区（TMs）。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。利用NetPhos 3.1 Server 对 CsSULTRs 的磷酸化位点进行预测发现，第 1 亚家族两个成员 CsSULTR1.1和 CsSULTR1.2 的磷酸化位点较少，分别为 46 个和 44 个；CsSULTR3.5 的磷酸化位点最多，共有 63 个磷酸化位点（表 2.3）。

【参考文献】