合成阿糖鸟苷关键酶的基因克隆与表达

发布时间：2020-08-23 07:49

【摘要】：核苷类化合物是抗癌、抗病毒药物的主要来源,阿糖鸟苷(ara-G)作为奈拉滨等的前药,能够有目的地抑制T细胞白血病的细胞活性,也是一种关键的抗癌类核苷类药物。目前利用化学合成法工艺比较麻烦,使用某些化学试剂对人体和环境都可能造成一定的危害;而生物催化法在一定程度上可以解决上述问题,但也存在野生菌株酶产量较低而导致成本较高、同时一些产酶的微生物菌体本身可能具有致病性,从而阻碍了工业化生产。本文通过分子生物学技术对ara-G生物合成过程中所用关键酶进行克隆表达,以获得催化反应所用酶的高产基因工程菌,大幅度降低成本,为工业化生产奠定基础。1.嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)与尿苷磷酸化酶基因(udp)工程菌的构建:根据GenBank中的deoD与udp的序列设计引物,利用PCR扩增来源于埃希氏菌AEM0812菌株的deoD与udp基因,将基因片段分别与克隆载体pMD18-T连接得到重组质粒pMD18-T-deoD和pMD18-T-udp,再将重组质粒分别导入Escherichia coli DH5α获得目的基因的克隆;然后将目的基因分别与表达载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-deoD和pET-28a-udp,导入E.coli BL21(DE3),获得工程菌菌株E.coli(deoD)、E.coli(udp);经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测表明目的基因表达成功。工程菌E.coli(deoD)与E.coli(udp)粗酶液酶活力分别是原始菌株的1.9倍与1.2倍。2.工程菌E.coli(deoD)或E.coli(udp)催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷(ara-DA):利用E.coli(deoD)或E.coli(udp)游离细胞或由其制备的粗酶液分别催化第一步反应,均能够生成ara-DA,并且E.coli(deoD)与E.coli(udp)游离细胞转化率比原始菌株AEM0812分别提高24.6%与22.3%,E.coli(deoD)与E.coli(udp)的粗酶液比原始菌株分别提高28.2%与2.0%;将E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游离细胞或粗酶液按照1:1的比例混合参与反应时,转化率相对于原始菌株AEM0812有明显的提高,尤其是E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游离细胞的混合液效果最佳,转化率是原始菌株的2.5倍。3.腺苷脱氨酶基因(add)工程菌的构建:将来源于Pseudomonas aeruginosa TX16菌株的add基因克隆后导入E.coli BL21(DE3),得到含有重组质粒pET-28a-add的工程菌E.coli(add),经IPTG诱导后采用SDS-PAGE检测,表明目的基因表达成功。酶活测定表明E.coli(add)粗酶液的酶活力是原始菌株P.aeruginosa TX16的2.9倍。4.工程菌E.coli(add)催化合成ara-G:将E.coli(add)菌体直接加入到含有ara-DA的反应体系中,HPLC检验结果表明E.coli(add)菌体游离细胞几乎不能催化合成ara-G;将E.coli(add)菌体细胞破碎后制成粗酶液再进行反应,可以成功催化第二步反应生成ara-G,而且转化率比原始菌P.aeruginosa TX16有非常显著的提高,其转化率可达96.8%,是原始菌株的2.2倍。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;Q55
【图文】：

图 1-1 两步法生成阿糖鸟苷的机理Fig.1-1 The mechanism of two-step enzymatic synthesis of guanine arabinosideUPase：尿嘧啶核苷磷酸化酶 PNPase：嘌呤核苷磷酸化酶 AMPDAase：腺苷脱氨酶在本实验室前期工作过程中，曹倩等[83,84]采用埃希氏菌（Escherichia sp.）与铜假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa TX16）按照上述机理合成 ara-G； 同时为解决菌

图 2-1 重组 DNA 构建示意图Fig 2-1 The construction of a schematic diagram of the reorganized DNA以 PNPase 为例（如图 2.1），以大肠埃希氏菌 AEM0812 的基因组为模板，用 PCR量扩增出嘌呤核苷磷酸化酶基因，此过程用的是 LA Taq 酶，它属于高保真酶，既保

图 2-2 pMD18-T 和 pET-28a 载体图谱Fig 2-2 The vector map of pMD18-T and pET-28a上述实验实现了相关基因重组菌的成功构建，证明目的基因已经导入宿主菌，还要证明相应的蛋白是否表达。因此，在相关基因工程菌构建完成后，在 IPTG 的诱导

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本文编号：2801272