中华绒螯蟹5-HT7和DA2受体基因克隆及几种生理过程中的表达分析
发布时间:2020-08-27 07:08
【摘要】:生物胺广泛分布于甲壳动物的神经系统组织,其中5-羟色胺(serotonin,5-HT)和多巴胺(dopamine,DA)参与调节动物机体的诸多重要的生理功能,包括繁殖、摄食和攻击行为等,而对中华绒螯蟹中这两种生物胺的研究尚未见报道。本研究为了探究5-HT和DA是否参与了中华绒螯蟹繁殖、光期适应和摄食的生理过程,首先对中华绒螯蟹5-HT7受体和DA2受体进行了初步探究,并对它们在多种组织中的表达进行了分析,随后筛选5-HT7和DA2表达较高的组织,对它们在上述生理过程中的表达情况进行分析,同时我们进行了不同浓度的色氨酸(5-HT前体物质)饲料对中华绒螯蟹5-HT受体、蜕壳相关受体和消化酶影响的研究,结果如下:本论文采用逆转录PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplication of cDNA ends,RACE)获得中华绒螯蟹5-HT7(GenBank accession number:GM601745)和DA2(GenBank accession number:MF683118)受体基因的全长序列。其中,5-HT7受体基因全长包含2328个核苷酸,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)含有1773个核苷酸(包含终止密码子),编码590个氨基酸;DA2序列全长2369bp,开放阅读框中含1770bp,编码589个氨基酸。两者都属于G-蛋白偶联受体超家族,具有七个跨膜区,包含高度保守的DRY残基和其他多个保守区。通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)技术研究这两个基因在中华绒螯蟹不同组织和不同卵巢发育阶段、不同光周期和不同摄食阶段下的表达情况。结果显示上述两个基因在眼柄、肝胰腺、胸神经节、肠道、脑神经节、腮、肌肉、血淋巴和心脏等9个组织中均有表达,并且在脑、胸神经节中表达水平最高,而且在肠道中5-HT7受体的表达水平与脑、胸神经节无显著性差异(P0.05),与其他组织表达水平有显著性差异(P0.05)。随着中华绒螯蟹的生长和卵巢的发育,Ⅲ期和Ⅳ期卵巢中5-HT7受体的表达水平显著高于Ⅰ期(P0.05),而DA2的表达水平在Ⅰ-Ⅴ期呈现下降趋势,Ⅳ期卵巢DA2的表达水平显著低于Ⅰ期和Ⅱ期(P0.05)。在胸神经节中,持续光照下5-HT7受体表达水平显著提高;在脑神经节中,持续黑暗显著增加了DA2的表达量。在摄食后,肝胰腺和肠道中5-HT7和DA2受体表达量均显著上升。这些数据表明,5-HT7受体对中华绒螯蟹的卵巢成熟具有一定的促进作用,而DA2受体对卵巢成熟有抑制作用;5-HT7受体和DA2受体参与中华绒螯蟹的光期适应和摄食消化过程。本论文通过投喂不同浓度(0.36%(A组),0.47%(B组),0.73%(C组)和1.05%(D组))色氨酸饲料,探讨色氨酸对中华绒螯蟹脑神经节、胸神经节、肠道和肝胰腺四种组织中5-HT受体基因(5-HT1B、5-HT2B、5-HT7)、蜕壳相关基因(Chi、EcR、MIH)表达水平和肝胰腺消化酶的影响。结果显示,随着饲料中色氨酸浓度的增加,血淋巴中5-HT水平逐渐上升;脑、胸神经节中5-HT1B受体mRNA的表达水平也逐渐升高;肠道中5-HT2B受体mRNA的表达水平逐渐下降;脑神经节和肠道中5-HT7 mRNA的表达水平也逐渐上升。此外,胸神经节中几丁质酶(Chi)基因mRNA的表达量随色氨酸浓度的升高而增加;蜕皮激素受体基因(EcR)在肝胰腺中的表达量呈下降趋势;肠道中B组和胸神经节中C组的蜕皮抑制激素(MIH)基因的表达量显著高于其他三组。肝胰腺蛋白酶活性C组显著高于A、B两组,C组与D组无显著性差异;随着色氨酸浓度增加,淀粉酶活性和脂肪酶活性呈下降趋势。这些结果表明色氨酸作为5-HT的前体物质,对5-HT受体的表达发挥显著的影响作用,而且参与调控中华绒螯蟹蜕壳,但对消化酶活性具有一定的抑制效果。以上研究表明中华绒螯蟹各组织中均有5-HT7和DA2基因表达,它们参与中华绒螯蟹繁殖、光期适应和摄食消化等生理过程,对中华绒螯蟹的生长发育具有重要作用,另外,色氨酸作为5-HT的前体物质,能够调节中华绒螯蟹蜕壳和消化。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S917.4
【图文】:
-HT的生物合成路径1
[11]。图1-2 DA的生物合成和代谢路径Fig. 1-2 The biosynthesis and metabolic pathways of DA2 5-HT 和 DA 的受体分类及功能2.1 5-HT 受体分类与功能2.1.1 5-HT 受体分类细胞外或突触间隙的 5-HT 通过与细胞膜或突触后膜上相应的 5-HT 受体结合发挥作用。5-HT 受体广泛分布于机体各组织中,分为 7 种亚型(5-HT1 5-HT7),超过 14 个小亚型,其中除了 5-HT3 为配体门控离子通道以外,其余均为 G-蛋白
ioEdit7 软件及多序列对比工具进行氨基酸序列对比。EGA5.0 软件的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建不同进化树。 5-HT7 受体基因的全长克隆及其生物信息学分析长 cDNA 序列的获得组数据中 5-HT7 受体的 EST,进行 RACE 克隆,获得的 3’和约为 480bp 和 1600bp(图 2-1)。将 PCR 的条带回收及克段大小分别为 467bp 和 1522bp,然后将 EST 与 3’-RA进行拼接,获得中华绒螯蟹 5-HT7 cDNA 全长为 2328bp。
本文编号:2805789
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S917.4
【图文】:
-HT的生物合成路径1
[11]。图1-2 DA的生物合成和代谢路径Fig. 1-2 The biosynthesis and metabolic pathways of DA2 5-HT 和 DA 的受体分类及功能2.1 5-HT 受体分类与功能2.1.1 5-HT 受体分类细胞外或突触间隙的 5-HT 通过与细胞膜或突触后膜上相应的 5-HT 受体结合发挥作用。5-HT 受体广泛分布于机体各组织中,分为 7 种亚型(5-HT1 5-HT7),超过 14 个小亚型,其中除了 5-HT3 为配体门控离子通道以外,其余均为 G-蛋白
ioEdit7 软件及多序列对比工具进行氨基酸序列对比。EGA5.0 软件的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建不同进化树。 5-HT7 受体基因的全长克隆及其生物信息学分析长 cDNA 序列的获得组数据中 5-HT7 受体的 EST,进行 RACE 克隆,获得的 3’和约为 480bp 和 1600bp(图 2-1)。将 PCR 的条带回收及克段大小分别为 467bp 和 1522bp,然后将 EST 与 3’-RA进行拼接,获得中华绒螯蟹 5-HT7 cDNA 全长为 2328bp。
【参考文献】
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本文编号:2805789
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